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Previous issue date: 2018-02-20 / Protease inhibitors have a broad biotechnological application, which goes since the development of several drugs to your utilization as a bioinsecticide, antifungal and as an antibacterial agent. However, those are found in small quantities in their natural sources, which unfeasible it utilization in industrial scale. Therefore, the heterologous production ends up as a method that allows the increase of scale production of those proteins. The Inga laurina Trypsin Inhibitor (ILTI) previously characterized showed an inhibitory effect in proteases extracted from the midgut of insects, besides reducing its larval developments by up to 84%, therefore, boing a candidate to be used as a potential bioinsecticide. Thus, the present work aimed at the heterologous production of ILTI in Komagataella phaffii (Pichia pastoris), followed by the optimization of the culture modes in a bioreactor with the objective of maximizing the production of the recombinant protein. For this, the gene that codifies ILTI were cloned in the expression vector pPIC9K, followed by your insertion on the strain GS115 by electroporation. PCR analysis showed that the recombinant vector was integrated into the genome of the yeast, and all the clones obtained had MutS genotype. The expression was performed for 96 hours by adding 0.5% methanol. An analysis of the proteins on the supernatant of the recombinant strain culture, by SDS-PAGE, confirmed the production of a protein with a size close to 20 KDa. Data from MALDI-TOF confirmed that the obtained protein is, in fact, the recombinant ILTI. Furthermore, inhibitory assays showed that the produced protein had activity against trypsin. Thus, culture in bioreactors was performed to optimize the production of this heterologous protein. In order to increase its expression, fed-batch was performed where on the batch phase the biomass production was favored, and the feeding phase was programmed to continuously supply methanol, based on the methanol specific consumption and its specific growth velocity, using methanol as carbon source. During the fermentations, 351.27 UIT were obtained in the extract of crude fermentation broth, and a specific activity of 2.07 UIT/mg protein. Although widely used as a host for the production of heterologous proteins, studies of the production of protease inhibitors in K. phaffii are still very limited. Until the moment, there is no report in the optimization of the production of serine protease inhibitors in K. phaffii, making this study pioneering and essential for the beginning of scaling up the process of this technology. / Os inibidores de protease possuem uma ampla aplica????o biotecnol??gica que vai desde o desenvolvimento de diversos f??rmacos at?? sua utiliza????o como bioinseticidas, antif??ngicos e como agentes antibacterianos. Por??m, estes s??o encontrados em pequenas quantidades nas suas fontes naturais, o que inviabiliza sua utiliza????o em escala industrial. Sendo assim, a produ????o heter??loga acaba sendo um m??todo que permite o aumento da escala de produ????o dessas prote??nas. O inibidor de tripsina de Inga laurina (ILTI) foi caracterizado previamente e mostrou possuir efeito inibit??rio em proteases extra??das do trato digestivo de insetos, al??m de diminuir em at?? 84% seu desenvolvimento larval, sendo, portanto, um candidato a ser utilizado como um poss??vel bioinseticida. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo a produ????o heter??loga do inibidor ILTI, em Komagataella phaffii (Pichia pastoris), seguido da otimiza????o dos modos de cultivo em biorreator com o objetivo de maximizar a produ????o da prote??na recombinante. Para isso, o gene que codifica o ILTI foi clonado no vetor de express??o pPIC9K seguindo de sua inser????o na cepa GS115 por eletropora????o. An??lises de PCR mostraram que o vetor recombinante foi integrado ao genoma da levedura e que todos os clones obtidos possu??am gen??tipo MutS. A indu????o da express??o foi realizada durante 96 horas por meio da adi????o de metanol ?? 0,5%. A an??lise de prote??nas presentes no sobrenadante da cultura da cepa recombinante, por meio de SDS-PAGE, confirmou a produ????o de uma prote??na com tamanho pr??ximo a 20 KDa. Dados obtidos em MALDI-TOF confirmaram que a prote??na obtida ?? de fato ILTI recombinante. Al??m disso, ensaios inibit??rios mostraram que a prote??na produzida possui atividade contra tripsina. Dessa forma, cultivo em biorreatores foram realizados com a finalidade de otimizar a produ????o dessa prote??na heter??loga. A fim de aumentar sua express??o foram realizadas bateladas alimentadas, onde durante a fase de batelada foi favorecida a produ????o de biomassa, e a fase de alimenta????o programada para fornecer metanol de forma cont??nua, com base nos dados de velocidade espec??fica de consumo de metanol e velocidade de crescimento espec??fica nesta fonte de carbono. Ao longo das fermenta????es realizadas foi obtido 351,27 UIT no extrato bruto do caldo fermentado e uma atividade espec??fica de 2,07 UIT/mg de prote??na. Apesar de ser amplamente utilizada como hospedeira para a produ????o de prote??nas heter??logas, estudos da produ????o de inibidores em K. phaffii ainda s??o muito limitados. At?? o momento n??o existem relatos de otimiza????o da produ????o de inibidores de serinoproteases em K. phaffii, sendo esse estudo pioneiro e essencial para o in??cio do processo de escalonamento dessa tecnologia.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:bdtd.ucb.br:tede/2378 |
| Date | 20 February 2018 |
| Creators | Carneiro, F??bio Correia |
| Contributors | Parachin, N??dia Skorupa |
| Publisher | Universidade Cat??lica de Bras??lia, Programa Strictu Sensu em Ci??ncias Gen??micas e Biotecnologia, UCB, Brasil, Escola de Sa??de e Medicina |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UCB, instname:Universidade Católica de Brasília, instacron:UCB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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