The Calvin – Benson cycle is the most widespread metabolic pathway capable of fixing CO2 in nature and a target of very high interest to metabolic engineers worldwide. In this study, 12 metabolites (ATP, AMP, NADP, NADPH, 2PG, 3PGA, FBP, RuBP, PEP, AKG, Ac-CoA and phenylalanine) were tested for protein – metabolite interactions against the proteome of Cupriavidus necator (previously Ralstonia eutropha) in the hopes of finding potential examples of allosteric regulation of the Calvin – Benson cycle. This is accomplished through the use of the LiP-SMap method, a recently developed shotgun proteomics method described by Piazza et al. capable of testing a metabolite of interest for interactions with the entire proteome of an organism at once. A functional protocol was developed and 234 protein – metabolite interactions between ATP and the proteome of C. necator are identified, 103 of which are potentially novel. Due to time constraints and setbacks in the lab, significant results were not produced for the other 11 metabolites tested. C. necator is an industrially relevant chemolithoautotroph that can be engineered to produce many valuable products and is capable of growth on CO2 and hydrogen gas. The bacteria were grown in continuous cultures after which the proteome was extracted while retaining its native state. Subsequently, the proteome was incubated with a metabolite of interest and subjected to limited, non-specific proteolysis. The resulting peptide mix was analyzed by liquid chromatography coupled tandem mass spectrometry (LC – MS/MS). / Calvin-Benson-cykeln är den mest utbredda metaboliska processen i naturen med vilken det är möjligt att fixera CO2 och en måltavla av högsta intresse för bioteknologer världen över. I den här studien testades 12 metaboliter (ATP, AMP, NADP, NADPH, 2PG, 3PGA, FBP, RuBP, PEP, AKG, Ac-CoA and phenylalanine) för interaktioner mot proteomet från Cupriavidus necator (tidigare Ralstonia eutropha) i hopp om att hitta potentiella exempel på allosterisk reglering av Calvin-Benson-cykeln. Detta uppnåddes genom användning av LiP-SMap-metoden, en nyligen utvecklad proteomikmetod beskriven av Piazza et al. kapabel av att testa en metabolit av intresse mot en organisms hela proteom simultant. Ett funktionellt protokoll utvecklades och 234 interaktioner mellan ATP och proteomet av C. necator identifierades, varav 103 potentiellt är nyupptäckta. På grund av tidsbrist och motgångar i labbet producerades inga signifikanta resultat för de resterande 11 metaboliterna som testades. C. necator är en industriellt relevant kemolitoautotrof som kan växa på CO2 och vätgas, samt manipuleras till att producera många värdefulla produkter. Bakterierna odlades i kemostater varefter proteomet extraherades i sitt naturliga tillstånd. Sedan inkuberades proteomet med en metabolit av intresse och utsattes för begränsad, icke-specifik proteolys. Den resulterande peptidblandningen analyserades via tandem masspektrometri kopplad till vätskekromatografi (LC – MS/MS).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-278729 |
| Date | January 2020 |
| Creators | Sporre, Emil |
| Publisher | KTH, Skolan för kemi, bioteknologi och hälsa (CBH) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-CBH-GRU ; 2020:179 |
Page generated in 0.0026 seconds