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Previous issue date: 2014-12-05 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Tuberculosis is a global public health problem and despite the recent reduction in the incidence of new cases and deaths worldwide, there are still developing countries where these indices are not so optimistic. The only vaccine recommended to TB by WHO is BCG that, although effective against severe forms of childhood TB, has a questionable efficacy against pulmonary tuberculosis in adults. In the pursue for a molecular improvement for BCG and thus enable the development of a widely used method of prophylaxis, a recombinant BCG was produced by electroporation of BCG Moreau, using three different recombinant plasmid constructions (pLA71, pLA73 and pMIP12), all of them containing the fusion protein CMX coding sequence. However, only the pLA71 transformant expressed the CMX fusion protein in the western blot. In order to evaluate the profile of memory B cells, the specific antibodies against CMX and the efficacy of the vaccine, BALB/c mice were immunized with a single dose of BCG or rBCG-CMX or PBS (control). Serum samples were collected from all animals 30, 60 and 90 days after the immunization and the induction of memory B cells was assessed by flow citometry of the splenocytes cell suspensions. Ninety days after the last immunization, animals were challenged with Mtb H37Rv by the intravenous route and forty five days later, lungs were harvested to analyze the bacterial load and the level of inflammation induced by the infection in immunized mice. Even though no specific antibodies against rCMX, rHspX and rMPT-51 proteins were detected, animals immunized with rBCG-CMX showed specific IgG1 (p<0,0001) and IgG2a (p=0,0007) levels against the BCG culture sediment, higher than those induced in the animals vaccinated with BCG. Besides, the rBCG-CMX vaccine was able to induced delayed long lived memory B cells (p=0,0069), reduced the bacterial load in the lungs (p=0,0041) in a similar way as BCG and generated less tissue damage when compared to BCG Moreau. The recombinant BCG vaccine expressing the CMX fusion protein induced specific antibodies for BCG extract and B cell response to stronger memory than BCG, but, the protection induced by both vaccines (BCG and rBCG) were similar. / A tuberculose (TB) constitui um problema de saúde pública mundial e apesar da recente redução da incidência de novos casos e de mortes em todo mundo ainda há países em desenvolvimento onde estes índices ainda não são tão otimistas. A única vacina indicada pela Organização Mundial de Saúde (OMS) contra a TB é a BCG que embora esta seja eficiente contra as formas graves de TB na infância, apresenta uma eficácia questionável contra a tuberculose pulmonar (TBP) em adultos. Com o objetivo de contribuir para o melhoramento molecular da BCG e possibilitar assim o aprimoramento de um método de profilaxia amplamente utilizado, foram produzidos, por eletroporação da BCG (subcepa Moreau), três recombinantes utilizando diferentes construções plasmidiais (pLA71, pLA73 e pMIP12), ambas, contendo sequência codificadora para a proteína de fusão CMX de Mycobacterium tuberculosis. No entanto,
apenas o transformante utilizando o pLA71 apresentou expressão da proteína CMX no imunoblot. Com o objetivo de avaliar o perfil de células B de memória, anticorpos específicos para CMX e a eficácia da vacina, camundongos BALB/c foram imunizados com dose única de BCG ou rBCG-CMX ou PBS (controle). A avaliação do perfil de células B de memória induzido pela imunização foi realizada 30 e 90 dias após a imunização, pela marcação de esplenócitos para citometria de fluxo. Noventa dias após a imunização, os animais foram desafiados, via endovenosa, com Mtb H37Rv e 45 dias após, foram obtidos pulmão dos camundongos para determinação da carga bacilar e do nível de inflamação induzido pela infecção nos camundongos imunizados. Não foram detectados níveis séricos de anticorpos específicos para proteínas rCMX, rHspX e rMPT-51, no entanto, animais vacinados com a rBCG-CMX apresentaram níveis de anticorpos séricos, das classes IgG1 (p<0,0001) e IgG2a (p=0,0007), específicos para extrato de BCG superiores ao induzido em animais vacinados com a BCG. Além disso, a vacina rBCG-CMX mostrou-se capaz de induzir tardiamente células B de memória de vida longa (p=0,0069); reduzir a carga bacilar no pulmão de camundongos infectados com Mtb (p=0,0041), semelhante ao BCG; e promover menor dano tecidual no pulmão de animais vacinados e infectados com Mtb. A vacina BCG recombinante expressando a proteína de fusão CMX mostrou-se capaz de induzir anticorpos específicos para extrato de BCG e resposta de células B de memória mais robustas do que a BCG, entretanto, a proteção induzida por ambas as vacinas (BCG e rBCG) foram semelhantes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tede/7180 |
| Date | 05 December 2014 |
| Creators | Costa Júnior, Abadio de Oliveira da |
| Contributors | Junqueira-Kipnis, Ana Paula, Kipnis, André, Junqueira-Kipnis, Ana Paula, Cardoso, Ludimila Paula Vaz, Fonseca, Simone Gonçalves da |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical e Saúde Publica (IPTSP), UFG, Brasil, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública - IPTSP (RG) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 6085308344741430434, 600, 600, 600, 600, -7769011444564556288, 5989919188376747614, -2555911436985713659 |
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