O carcinoma da bexiga urinária (CB) é a segunda doença maligna mais frequente do trato urinário. Devido a baixa eficácia dos tratamentos intravesicais atuais (imunoterapia com BCG e quimioterapia), seja pelo baixo tempo de residência do fármaco na bexiga ou pela baixa permeabilidade no urotélio, novas estratégias que aumentem esse tempo de residência do fármaco e sua penetração na bexiga têm sido investigadas. Dentre estas estratégias pode-se citar os sistemas de liberação sustentada nanoestruturados, que liberam o fármaco gradativamente, protegem o fármaco encapsulado, aumenta a biodisponibilidade, aumentando a eficácia da terapia e diminuindo os efeitos adversos. Nesta linha, o objetivo desse trabalho foi produzir e utilizar carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) como sistema de carreamento de doxorrubicina (DOXO) e a sua avaliação biológica em células de câncer de bexiga. Os CLN, compostos por manteiga de Illipê (lipídeo sólido), ácido oleico (óleo) e o estabilizante Pluronic F68, foram preparados pelo método de emulsão a quente e sonicação. A caracterização físico-química do CLN foi realizada determinando o diâmetro hidrodinâmico médio e potencial zeta (carga superficial) por espalhamento de luz dinâmico (DLS), cristalinidade por calorimetria exploratória diferencial (DSC), eficiência de encapsulamento por espectrofotometria UV-vis, ensaio de citotoxicidade em células RT4 e análise de permeação ex vivo e in vivo das formulações aplicadas em bexiga de porco por microscopia confocal. O diâmetro hidrodinâmico médio dos CLN sem o fármaco foi de 103 nm e seu PdI (índice de polidispersão) igual a 0,2. O encapsulamento da DOXO aumentou o diâmetro dos CLN para 112 nm e o valor de PdI foi de 0,2. O baixo valor de PdI indica formulações com baixa polidispersão. Os valores de potencial zeta dos CLN sem e com DOXO foram ambos negativos, variando de -5 mV a -25 mV. Nos termogramas das amostras de CLN-DOXO não foi observado o pico referente a fusão da DOXO em 197,93ºC, indicando que o fármaco provavelmente está molecularmente disperso na matriz lipídica. Nos ensaios de citotoxicidade, a formulação CLN-DOXO mostrou-se mais citotóxica do que a DOXO livre em baixas concentrações (31-250 ng/mL). O valor de IC50 reduziu 2,1 vezes quando a DOXO foi encapsulada. Essa maior atividade antitumoral in vitro pode estar relacionada ao aumento do uptake celular como confirmado pelos ensaios de citometria de fluxo. No estudo de permeação ex vivo em bexiga de porco foram observadas permeações muito semelhantes das formulações de DOXO livre e encapsulada em CLN. Porém no ensaio in vivo a DOXO encapsulada permeou mais que a DOXO livre. Os resultados obtidos apontam para um promissor sistema de liberação de doxorrubicina para a terapia do câncer de bexiga. / Urinary bladder carcinoma (BC) is the second most common malignant disease of the urinary tract. Due to the low efficacy of current intravesical treatments (BCG immunotherapy and chemotherapy), either because of the low residence time of the drug in the bladder or due to low permeability in the urothelium, new strategies that increase the residence time of the drug and its penetration into the bladder have been investigated. These strategies include nanostructured sustained release systems, which release the drug gradually, protect the encapsulated drug, increase the bioavailability; increasing the effectiveness of the therapy and reducing side effects. In this line, the aim of this work was to produce and apply nanostructured lipid carriers (NLC) as a doxorubicin delivery system (DOXO) and its biological evaluation in bladder cancer cells. The NLC, composed by Illipe butter (solid lipid), oleic acid (oil) and Pluronic F68 stabilizer, were prepared by the hot emulsion and sonication method. The physical-chemical characterization of these NLC was performed by measured the mean hydrodynamic diameter and zeta potential (surface charge) by dynamic light scattering (DLS), crystallinity by differential scanning calorimetry (DSC), encapsulation efficiency by UV-vis spectrophotometry, cytotoxicity assay in RT4 cells and ex vivo and in vivo permeation assay of formulations applied to pig bladder by confocal microscopy. The mean hydrodynamic diameter of NLC without the drug was 103 nm and its PdI (polydispersity index) was 0.2. The encapsulation of DOXO increased the NLC diameter to 112 nm and the PdI value was 0.2. The low value of PdI indicates formulations with low polydispersion. The zeta potential values of the NLC without and with DOXO were both negative (-5 mV to -25 mV). In the thermograms of the NLC-DOXO sample the fusion peak of DOXO at 197.93 was not observed, indicating that the drug is molecularly dispersed in the lipid matrix. In the cytotoxicity assays, the NLC-DOXO formulation was more cytotoxic than free DOXO at low concentrations (31-250 ng/mL). The IC50 value was reduced 2.1 fold when DOXO was encapsulated. This increased in vitro antitumor activity may be related to increased cell uptake as confirmed by flow cytometry analysis. In the ex vivo permeation study in the pig bladder, a very similar permeation was observed between free and encapsulated DOXO. However, in the in vivo assay the encapsulated DOXO permeated more than free DOXO. The results indicates a promising release system of doxorubicin to bladder cancer therapy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-08012019-142441 |
| Date | 19 October 2018 |
| Creators | Alexandre Rodrigues Gaspari |
| Contributors | Rodolfo Borges dos Reis, Ricardo Carneiro Borra, Marlus Chorilli, Wilson Araújo da Silva Junior |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Medicina (Clínica Cirurgica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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