Obwohl inzwischen über 200 verschiedene Serogruppen von V. cholerae bekannt sind, wurden Ausbrüche der Cholera hauptsächlich von Stämmen der unbekapselten Serogruppe O1 und der bekapselten Serogruppe O139 verursacht. Die Komponenten des Lipopolysaccharids (LPS) von O1 und O139, sowie die Kapsel von O139 tragen zur Kolonisierung im Gastrointestinaltrakt bei. Um die Funktion des LPS und der Kapsel als Virulenzfaktor näher zu untersuchen, wurden Adhäsionsstudien mit definierten LPS- und/ oder Kapsel-Mutanten beider pathogener Serogruppen durchgeführt. Dazu wurde die Mukus-produzierende humane Darmzelllinie HT-29-Rev MTX verwendet. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (Wt) konnte für eine O Antigen-Mutante von O1 eine Reduktion um 85%, für eine O Antigen/ Kapsel-Mutante von O139 eine Reduktion um 70% in der Adhäsionsrate festgestellt werden. Ein Beitrag von ToxR regulierten Genprodukten ist ebenfalls möglich. Weiterhin wurden mit WavJ und WavD zwei Genprodukte der Kernoligosaccharid -Biosynthese charakterisiert, welche bislang nur in dem wa*-Genclustertyp 1 der klinischen Isolate nachgewiesen worden sind. Es konnte gezeigt werden, dass beide Genprodukte an der Biosynthese des Kern OS beteiligt sind, wobei WavJ mit hoher Wahrscheinlichkeit die Heptosyl-IV-Transferase darstellt. Die wavDJ-Doppelmutanten beider Serogruppen wiesen eine erhöhte Sensitivität gegenüber Novobiocin auf. Dagegen konnte eine Attenuation der Mutanten im Mausmodell nur für die Serogruppe O139 demonstriert werden. Ein Schlüsselenzym der LPS-Biosynthese stellt die Oberflächenpolymer:Lipid A-Kern OS-Ligase (WaaL), kurz O Antigen-Ligase genannt, dar. In dieser Arbeit wurden die in der Primärstruktur stark unterschiedlichen Ligasen aus einem pathogenen (P27459) und apathogenen (V194) V. cholerae Isolat strukturell und funktionell analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität beider Ligasen von der Anwesenheit eines N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Kernoligosaccharid abhängig ist. Dieser Zucker wird durch das Genprodukt WavL transferiert, welchem in dieser Arbeit die Aktivität einer N-Acetylglucosaminyltransferase zugeordnet werden konnte. Das Gen wavL wurde in allen zur Verfügung stehenden V. cholerae Isolaten nachgewiesen und stellt wahrscheinlich eine generelle Voraussetzung des Kern OS für eine O Antigen-Anheftung dar. Im Gegensatz dazu, diskriminiert die An- bzw. Abwesenheit einer Galaktose (Gal) im Kern OS die Spezifität der Ligasen von V. cholerae P27459 bzw. V194. Dabei ist die Aktivität der Galaktosyltransferase WavM, essentiell für die Aktivität der Gal-abhängigen Ligase von V194. Die Gal-unabhängige Ligase von P27459 wird hingegen durch die Anwesenheit von Gal im Kern OS inhibiert. Hybridfusionen der beiden Ligasen deuten an, dass die Erkennungsdomäne für Gal in der C-terminalen Hälfte lokalisiert ist. Erstmals wurde die Topologie einer Ligase durch PhoA- und LacZ-Fusionen analysiert. Die Suche nach konservierten Aminosäuren (AS) in verschiedenen Ligasen führte zur Identifizierung der Motive R(X3)L und H(X10)G in zwei periplasmatischen Schleife. Ein Austausch des R oder des H in diesen Motiven führte zum Verlust der Ligase-Aktiviät von WaaL aus V. cholerae und S. enterica. Damit geben diese Motive einen ersten Hinweis auf das aktive Zentrum des Enzyms. Desweiteren wurde nach möglichen O Antigen-Transportern bei V. cholerae gesucht, welche bislang noch nicht identifiziert worden waren. Über die Anpassungen von V. cholerae an aquatische Ökosysteme, insbesondere hinsichtlich der wechselnden Osmolarität, ist nahezu nichts bekannt. Durch ein in dieser Arbeit konstruiertes und etabliertes Transposonsystem konnten 3600 Mutanten erzeugt und auf Wachstumsdefekte unter hypertonischen Bedingungen untersucht werden. Eine dieser osmosensitiven Mutanten wies eine Insertion in dem Locus VCA0565 auf, welcher für eine putative Sensor-Histidinkinase kodiert. Mit dem Regulator, kodiert durch VCA0566, stellt VCA0565 das putative Zwei-Komponentensystem OsmRK dar. Transkriptomanalysen von osmR/ K-Mutanten lieferten keine Erklärung des Wachstumsdefekts unter hypertonischen Bedingungen, zeigten aber eine Vernetzung der durch OsmR/ K regulierten Gene mit dem ToxR-Regulon auf. Analysen der Außenmembran demonstrierten, dass eine Mutation von osmR/ K zu einer Repression von OmpU unter hohen Salzkonzentrationen führt. Vergleichende Experimente mit weiteren Mutanten deuteten an, dass es in osmR/ K- und toxS-Mutanten unter erhöhten Salzkonzentrationen zur Degradation von ToxR kommt. Während die Deregulation von OmpU in osmR/ K-Mutanten nur unter Salzstress zu beobachten war, führte in der toxS-Mutante auch ein Membranstress durch Zugabe von Protamin zu einer Repression von OmpU. Die zu OsmR/ K nah verwandten putativen Zwei-Komponentensysteme EnvZ/ OmpR und VCA0257/ VCA0256 hatten unter keiner der getesteten Bedingungen einen Einfluss auf die Proteine der AM. Weiterhin wurde eine C-terminale Degradation von HutA unter hypertonischen Bedingungen aufgedeckt. / Although, more than 200 serogroups of V. cholerae.were identified, however, only the strains of the non-encapsulated O1 and the encapsulated O139 serogroups were found to be responsible for cholera epidemics. The components of the LPS of O1 and O139 play a crucial role in the colonization of the gastrointestinal tract. To analyze the contribution of the LPS and the capsule in the adhesion to epithelial cells, mucus layer attachment studies using defined O antigen and/ or capsule mutants of both serogroups and the human intestinal cell line HT29-Rev MTX were performed. In case of the O antigen mutant of O1 a 85% and for the O antigen and capsule mutant of O139 a 70% reduction in the adhesion rate was determined compared to wild type. It is likely that ToxR regulated gene products also contribute to the adhesion, since a toxR-mutant of O1 showed a 3-fold reduction in the adhesion rate. In addition the two gene products of the core oligosaccharide biosynthesis, WavJ and WavD, were characterized. So far the corresponding genes could only be found in the wa*-gene cluster type 1 of clinical isolates. It could be demonstrated, that single and double knockout mutants have an effect on core oligosaccharide biosynthesis in both serogroups. Based on bioinformatical data it is likely that WavJ represents the heptosyl-IV-transferase. Double mutants in wavJ and wavD of both serogroups showed an attenuated growth in the presence of novobiocin, whereas only the mutants in O139 demonstrated reduced colonization in the in vivo mouse model. The surface polymer:lipid A-core ligase (WaaL), also called the O antigen ligase, is a key enzyme in the LPS biosynthesis of Gram- bacteria. Part of this work focused on the structural and functional characteristics associated with the recognition of the core oligosaccharide of two distantly related ligases of a virulent (P27459) and an environmental (V194) V. cholerae isolate. It was demonstrated that the activity of both ligases is dependent on the presence of N-acetylglucosamine, which is attached to the core oligosaccharide by the WavL glycosyltransferase. The gene wavL could be found in all V. cholerae isolates so far. In contrast, an additional sugar substitution, i.e. galactose, which is transfered by the WavM galactosyltransferase, discriminates the core oligosaccharide specificity of the ligases of P27459 and V194. The activity of WavM is essential for the activity of the galactose-dependent ligase of V194, whereas it hinders the galactose-independent ligase of P27459 to transfer the O antigen onto the core oligosaccharide. WaaL protein hybrids between galactose dependent and non-dependent ligases indicate that the galactose recognition site is located in the C-terminal half. Using PhoA and LacZ fusions the topology of the ligase of P27459 was determined. Amino acid sequence alignments of WaaL proteins identified the distinct conserved motifs R(X3)L and H(X10)G in two periplasmic loops. By site directed mutagenesis of the histidine and arginine residues within these motifs, an abortism of O antigen transfer reaction for WaaLs of V. cholerae and Salmonella enterica was found. Furthermore the putative O antigen-transport systems of V. cholerae were investigated. In this work a new transposon system was constructed and established, resulting in 3600 mutants, which were screened for growth defects under hypertonic conditions. One of these mutants had an insertion in locus VCA0565, which encodes a putative sensor histidine kinase. In combination with the transcriptional regulator, encoded by VCA0566, they represent the putative two-component system OsmRK. Comparing the transcriptom of osmR/ K-mutants to the wild type revealed no explanation for the osmosensitive phenotype, but showed some interaction between the regulon of OsmR/ K and ToxR. Analysis of the outer membrane demonstrated, that a mutation in osmR/ K results in a repression of OmpU under hypertonic conditions. Comparative experiments, including additional mutants indicated a degradation of ToxR in osmR/ K- and toxS-mutants in presence of high salt concentrations. In contrast to osmR/ K-mutants, in the toxS-mutant the repression of OmpU could be also observed by a different membrane stress caused by protamine. In addition, the analysis of the outer membrane proteins revealed a C-terminal degradation of HutA under hypertonic stress conditions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:1101 |
| Date | January 2005 |
| Creators | Schild, Stefan |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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