Peptídeos antimicrobianos (PAMs) fazem parte do sistema de defesa de muitas plantas e animais, e apresentam potente ação contra micro-organismos parasitas e patógenos, sem causar danos às células do organismo hospedeiro. A seletividade dos peptídeos antimicrobianos por tais micro-organismos ocorre por diversos fatores, dentre eles a composição lipídica diferenciada de organismos procariotos e eucariotos. A camada externa da membrana celular de animais procariotos é composta, em parte, por lipídios negativos, diferindo da camada externa de organismos eucariotos, neutra. Logo, os peptídeos antimicrobianos, catiônicos, apresentam seletiva atração pela membrana de animais procariotos, como bactérias e fungos, devido à interação eletrostática. Deste modo, a interação do peptídeo com a membrana de organismos procariotos e eucariotos ocorre de modo diferenciado, levando a diferentes mecanismos de ação e efeitos. Para melhor compreensão da atividade de peptídeos antimicrobianos, este trabalho apresenta um estudo da interação do peptídeo antimicrobiano KHya1 com membranas modelo, que são sistemas miméticos de membranas celulares formados por lipossomos de composição lipídica controlada. O peptídeo KHya1 apresenta sequência (Ile - Phe - Gly - Ala - Ile - Leu - Phe - Leu - Ala - Leu - Gly - Ala - Leu - Lys - Ans - Leu - Ile - Lys - NH2) com 4 cargas positivas. Sua sequência primária provém de uma modificação com relação à sequência do peptídeo Hylina1, originalmente encontrado na secreção da pele do sapo, Hipsiboas albopunctatus. Ambos os peptídeos apresentam comprovada ação anti- bacteriana e anti- fúngica. Neste trabalho, a interação do peptídeo KHya1 com membranas modelo de composição lipídica neutra (DPPC, dipalmitoil fosfatidil colina), aniônica (DPPG, dipalmitoil fosfatidil glicerol) e mista (DPPC:DPPG, 1:1) foi estudada por meio de diversas técnicas experimentais: calorimetria diferencial de varredura (DSC), fluorescência estática e temporal, utilizando a sonda natural do peptídeo (Trp, Triptofano) e sonda extrínseca de bicamada (Laurdan), experimentos de vazamento de sonda fluorescente encapsulada, espalhamento de luz dinâmico (DLS), microscopia óptica, ressonância paramagnética eletrônica (ESR) e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). Esses estudos reportam que o peptídeo antimicrobiano KHya1 pode apresentar diferentes mecanismos em membranas neutras e aniônicas/ mistas, que estão relacionados a diferentes posições do peptídeo na bicamada, levando a modificações estruturais distintas nas membranas, dependendo de sua composição lipídica. Os resultados sugerem que o peptídeo KHya1 interage preferencialmente com a superfície da membrana neutra, causando uma perturbação média nos lipídios. Também foi observado neste caso, maior partição do peptídeo em solução aquosa, comparada à partição observada em dispersões lipídicas aniônicas. Por outro lado, o peptídeo KHya1 pode estar ancorado transversamente em membranas compostas por lipídios negativos. Resultados de SAXS sugerem que o peptídeo causa estreitamento da espessura da bicamada, tanto na fase gel quanto na fase fluida. Para os sistemas modelo compostos pela mistura de lipídios, foi observado que o peptídeo interage preferencialmente com os lipídios aniônicos, e as perturbações que o peptídeo causa em DPPC:DPPG são maiores do que as observadas para os sistemas neutro e aniônico. Esse efeito pode ser consequência da maior razão molar peptídeo-PG em vesiculas mistas, e/ou o peptídeo pode causar defeitos entres lipídios neutros e aniônicos, modificando a permeabilidade da membrana. Embora também seja observado vazamento em vesículas neutras, a microscopia óptica e medidas de vazamento de sonda fluorescente encapsulada mostraram diferentes mecanismos de vazamento de membranas neutras e aniônicas. Para altas concentrações de peptídeo grandes poros são formados levando ao colapso de vesículas compostas por lipídios aniônicos. Os diferentes efeitos do peptídeo antimicrobiano KHya1 em membranas neutra e aniônica, aqui observados, podem ter relevante importância para entender a ação eficaz de peptídeos antimicrobianos contra organismos procariotos, como bactérias e fungos, e ação reduzida em células eucariotas. / Antimicrobial peptides are part of the innate defense immunity system of several plants and animals. In general, they exhibit strong activity against pathogen microorganisms, without affecting the host cells. The antimicrobial peptides selectivity against specific target pathogens is due to several factors, including the different lipid composition of prokaryotic and eukaryotic membranes: for instance, they can be distinguished by the presence or absence of negatively charged lipids at the cell surface, respectively. Therefore, the electrostatic interaction between cationic antimicrobial peptides and anionic membranes can play an important role in the selectivity and activity of these peptides. Here, we present a study of the antimicrobial peptide KHya1 with model membranes: liposomes prepared with controlled lipid composition that mimic the membrane outer leaflet of bacterial and eukaryotic cells. Peptide KHya1 (Ile - Phe - Gly - Ala - Ile - Leu - Phew - Leu - Ala - Leu - Gly - Ala - Leu - Lys - Ans - Leu - Ile - Lys - NH2) has a net charge of +4. KHya1 primary sequence originates from a modification of the sequence of Hylina1, a peptide isolated from the secretion of the skin of the frog Hipsiboas albopunctatus. Both peptides are known to exhibit effective action against bacteria and fungi. The interaction of peptide KHya1 with model membranes composed by neutral (DPPC, dipalmitoyl phosphatidyl choline), anionic (DPPG, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol) and a mixture of both lipids (DPPC:DPPG, 1:1) was studied by the use of several different experimental techniques: differential scanning calorimetry (DSC), static and time-resolved fluorescence, using the peptide natural probe (Trp, Tryptophan) and an extrinsic bilayer probe (Laurdan), experiments of leakage of an entrapped fluorescent dye, dynamical light scattering (DLS), optical microscopy, electron spin resonance (ESR) and small-angle x-ray scattering (SAXS). The peptide KHya1 was found to interact differently with neutral and anionic membranes, located at different positions in the bilayer, and causing distinct membrane structural modifications. KHya1 preferentially interacts at the surface of neutral membranes, causing an average perturbation in the lipids. With DPPC, we also observed a larger partition of the peptide in aqueous solution, compared to the peptide aqueous partition in anionic lipid dispersions. In membranes composed of negatively charged lipids, the peptide KHya1 seems to be strongly anchored in a transmembrane position. SAXS results suggest that the peptide insertion causes membrane thinning, in both gel and fluid phases. For model systems composed by the mixture of neutral and anionic lipids, we observed that the peptide preferentially interacts with anionic lipids, and the changes the peptide causes in DPPC:DPPG vesicles are larger than those observed with pure anionic systems. This effect may be due to the larger peptide/PG molar ratio in DPPC:DPPG vesicles, and/or to lipid segregation caused by the peptide, and the consequent structural defects at the borders of neutral and anionic domains. Although KHya1 increases the permeability of neutral bilayers, optical microscopy and experiments of leakage of entrapped fluorescent dyes showed different mechanism of leakage for neutral and negatively charged bilayers. For high peptide concentrations, large pores are formed in anionic vesicles, leading to vesicle collapse. The new insights shown here about the different structural modifications caused by the antimicrobial peptide KHya1 in neutral and anionic vesicles can possibly explain the efficient action of this peptide against bacteria and its reduced effect in eukaryotic cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-23022016-104747 |
| Date | 21 January 2016 |
| Creators | Enoki, Thais Azevedo |
| Contributors | Lamy, Maria Teresa Moura, Riske, Karin do Amaral |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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