A hemofilia A é uma doença caracterizada pela deficiência do fator VIII (FVIII) de coagulação sanguínea e atinge 1 em 5000 homens. Países desenvolvidos, utilizam como terapia o FVIII recombinante (rFVIII), por apresentar maior segurança e consistir uma fonte ilimitada. Estudos realizados em nosso laboratório, utilizando o vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K, originaram as linhagens celulares humanas, HepG2FVIIIdB/P140K (hepática) e Hek293FVIIIdB/P140K (renal), que foram selecionadas pelo mesmo sistema de seleção, o tratamento in vitro com as drogas Benzilguanina e Temozolomide. O presente trabalho teve por objetivo caracterizar e detalhar o padrão de integração do vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K nas duas linhagens celulares humanas, e verificar se o perfil de integração está relacionado ao tipo celular específico ou se este sofre influência da estratégia de seleção a qual as células foram submetidas anteriormente. Foi utilizada a técnica de LM-PCR (ligação-mediada por PCR) que permite localizar o sítio de integração do vetor viral, por meio do sequênciamento do produto de PCR obtido após a digestão com enzimas de restrição e ligação de uma sequência adaptadora (LINKER) ao DNA genômico. Após o seqüenciamento as sequências foram submetidas a análises em bancos de dados de genomas (Human BLAT, QuickMap e DAVID/EASE) para caracterização dos respectivos clones. Também foi realizada uma análise da expressão relativa do mRNA relativo ao rFVIII por RT-PCR e da atividade biológica pelo teste de TTPA. Dessa forma foi possível observar que ambas as linhagens modificadas expressam o mRNA relativo ao rFVIII e que as células HepG2 e Hek293 apresentam níveis de secreção da proteína recombinante biologicamente ativa da ordem de 7,9 UI/mL e 2,1 UI/mL, respectivamente. Foram sequenciados um total de 201 clones da HepG2, sendo 123 similares ao genoma humano e dentre estes 73 considerados verdadeiros e 50 ambíguos. Da Hek293 foram sequenciados 221 clones, sendo 179 similares ao genoma humano e dentre estes 64 verdadeiros e 115 ambíguos. Observamos que o vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K apresenta um perfil de integração não randômico e diferente entre as células estudadas, uma vez que na linhagem HepG2 houve uma preferência pelos cromossomos 19, 17 e 11, e na Hek293 pelo cromossomo 9. Em relação a regiões genômicas tais como distância de ilhas CpGs e de sítios de ligação de fatores de transcrição não houve diferença no perfil de integração em ambas as linhagens celulares, visto que nas duas células o vetor se inseriu preferencialmente a uma distância de ± 30-60Kb dessas regiões. Observamos também que houve uma integração dentro de genes codificadores de proteínas da ordem de 52% e 44% nas células HepG2 e Hek293, respectivamente, contudo em ambos os casos mais de 90% dessas inserções ocorreram em regiões intrônicas. Houve 20% de integrações em sítios frágeis do genoma na linhagem HepG2 e 17% na Hek293. Em suma este trabalho mostrou a integração do vetor retroviral pMFG-FVIII-P140K específica para as duas linhagens em estudo. Além disso, pudemos observar que em ambas as linhagens celulares, HepG2FVIIIdB/P140K e Hek293FVIIIdB/P140K, existem regiões gênicas dentro dos cromossomos na qual o vetor exibe uma preferência. O perfil de integração caracterizado aqui difere de outros trabalhos da literatura que utilizaram retrovírus derivados de MLV. Isso nos leva a crer que o padrão de inserção descrito pode estar relacionado ao fato de que essas células foram tratadas anteriormente com drogas quimioterapêuticas para seleção de um clone celular com maior nível de produção de rFVIII, levando consequentemente a seleção de um perfil de integração semelhante entre as linhagens celulares, mesmo estas tendo origens teciduais diferentes. / Hemophilia A is a disease characterized by deficiency of blood clotting factor VIII (FVIII) and affects 1 in 5000 men. Developed countries use as therapy for Hemophilia A recombinant FVIII (rFVIII) because rFVIII concentrates have proven efficacy and safety and this therapy consist of an unlimited supply.. Studies in our laboratory using the retroviral vector pMFG-FVIII-P140K, originate the human recombinant cell lines, HepG2FVIIIdB/P140K (liver origen) and Hek293FVIIIdB/P140K (renal origen) which were selected with high doses of Benzyladenine and Temozolomide. This study aimed to characterize the integration pattern of retroviral vector pMFG-FVIII-P140K in these human cell lines, and verify if the profile of integration is related to specific cell type or it was influenced by the selection strategy which cells have been previously submitted. We used the technique of LM-PCR (ligation-mediated PCR) that allows to locate the site of viral vector integration by the sequencing of PCR products. The sequences were obtained after genomic DNA digestion with restriction enzymes and subsequent connection of an adapter (LINKER) to 5or 3 of the DNA fragment. The sequences were analyzed in genomic databases (Human BLAT, and Quickmap DAVID / EASE) for characterization of the respective clones. It was also performed an analysis of relative expression of rFVIII mRNA by RT-PCR and the biological activity was measured by APTT test. Thus it was observed that both cell lines express the mRNA relative to rFVIII and HepG2 and HEK293 cells have levels biologically active recombinant protein approximately 7.9 IU / mL and 2.1 IU / mL, respectively . We sequenced a total of 201 clones of HepG2FVIIIdB/P140K, 123 of these sequences match to the human genome and, among those 73 were considered true and 50 were ambiguous. In Hek293FVIIIdB/P140K 221 clones were sequenced, these total, 179 were similar to the human genome. 64 were true and 115 were ambiguous. We note that the retroviral vector pMFG-FVIII-P140K presents a profile of integration different and non-random between the studied cells lines, in HepG2FVIIIdB/P140K was observed a preference of integration for chromosomes 19, 17 and 11, and in Hek293FVIIIdB/P140K for the chromosome 9. In genomic regions such as CpG islands and transcription factors binding sites (TFBS), there was no difference in the profile of integration in both cell lines. In the two cell lines the vector is inserted preferably at a distance of ± 30 - 60Kb of these regions. We also observed that there was 52% of integration within genes encoding proteins (RefSeq genes) in HepG2FVIIIdB/P140K and 44% in Hek293FVIIIdB/P140K cells. In both cases more than 90% of the insertions occurred in intronic regions. There were 20% of integrations at fragile sites in the genome of HepG2 cell line and 17% in Hek293. In summary this study showed the integration profile of retroviral vector pMFG -FVIII-P140K in two different cell lines that produces FVIIIr protein are very similar. Furthermore, we observed that in both cell lines, HepG2FVIIIdB/P140K and Hek293FVIIIdB/P140K, there are genetic regions within the chromosomes in which the vector displays a preference. The integration profile featured described here differs in CpGs island and TFBS from other studies in the literature that used retroviruses derived from MLV. This leads us to believe that the integration pattern described here may be related to the fact that these cells were previously treated with chemotherapeutic drugs for selecting a cell clone with the highest level of production of rFVIII, consequently leading to selection of a similar profile integration between cell lines, even those having different tissue origins.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06072015-155930 |
| Date | 14 March 2011 |
| Creators | Freitas, Marcela Cristina Corrêa de |
| Contributors | Fontes, Aparecida Maria |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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