O Arapaima gigas, conhecido popularmente como pirarucu é uma espécie de peixe pertencente à ordem dos Osteoglossiformes, nativo da Bacia Amazônica e autóctone da Bacia de São Francisco e do Nordeste. É considerado um dos maiores peixes de água doce do mundo, chegando, na fase adulta, a três metros de comprimento e mais de 200 kg de peso, possuindo, portanto, uma grande importância para a alimentação e o comércio da região. Infelizmente esta espécie pertence à lista de animais sobre explorados do IBAMA, também em perigo de extinção, devido especialmente à pesca predatória e à sua dificuldade reprodutiva em cativeiro. Por estas razões, desenvolvemos o presente trabalho de clonagem e caracterização de um de seus hormônios da reprodução (gonadotrofinas), em particular o hormônio luteinizante (LH). Esta glicoproteína é constituída por duas subunidades ligadas de forma não covalente: a subunidade α (GTHα) comum também ao hormônio folículo estimulante (FSH) e a subunidade β, que confere a especificidade de sua ação biológica. Tanto o cDNA do ag-GTHα quanto aquele do ag-LHβ foram sintetizados pela reação de transcriptase reversa (RT) e pela reação de cadeia de polimerase (PCR) utilizando vários primers, a partir do RNA total obtido das glândulas hipofisárias de A.gigas. O cDNA de GTHα apresentou um comprimento total de 767 pb incluindo uma cadeia poli-A de 20 adeninas. Foi identificada uma região codificante (ORF) de 348 pb iniciando com o primeiro códon (ATG) na posição 58 e o códon de parada (stop) na posição 403. O sinal de poliadenilação (ATTAAA) foi localizado 18 pb antes da cauda poli-A. A região codificante traduz um peptídeo de 115 aminoácidos, com um sítio de clivagem do peptídeo sinalizador situado entre o aminoácido 24 e 25. A proteína apresenta portanto um suposto peptídeo sinal de 24 aminoácidos e um peptídeo maduro de 91 aminoácidos, que quando alinhado com outras espécies de peixes, mostra a conservação de 10 resíduos de cisteína, 3 prolinas e dois potenciais sítios de glicosilação entre os aminoáciodos 51-53 (NIT) e os aminoáciodos 77-79 (NHT). O cDNA de ag-LHβ apresenta um comprimento total de 711 pb, incluindo uma cadeia poli-A de 18 adeninas. Foi identificada uma região codificante (ORF) de 426 pb, iniciando com primeiro códon (ATG) na posição 47 e terminando na posição 469. O sinal de poliadenilação (AATAAA) foi localizado 18 pb antes da cadeia poli-A. A região codificante traduz um peptídeo sinalizador situado entre o aminoácido 24 e 25. Com isso, temos um peptídeo sinalizador de 24 e um peptídeo maduro de 117 aminoácidos que apresenta a conservação de 12 resíduos de cisteína, 6 prolinas e um sítio potencial de N-glicosilação identificado entre os aminoácidos 10-12 (NQT), enquanto um segundo possível sítio de N-glicosilação (alterado para QTT), entre os aminoácidos 27-29, foi perdido. Como na subunidade GTHα, a maior porcentagem de identidade de LHβ foi com os Cypriniformes (75.6%) enquanto a menor foi com os Gadiformes (53.8%). A análise filogenética realizada utilizando as sequências de FSHβ e LHβ de 41 espécies de peixes, incluido o A.gigas, confirmou os dados publicados relativos à subunidade GTHα, posicionando o A.gigas como grupo irmão dos Clupeocephala e os Elopomorpha (Anguilliformes) como grupo mais basal entre os teleósteos . / Arapaima gigas, popularly known as pirarucu, is a species of fish that belongs to the order of Osteoglossiformes, originating from the Amazon, São Francisco river basin and the North East of Brazil. It is considered one of the largest fresh water fishes in the world, reaching when adult three meters in length and more than 200 kg in weight. It is therefore very important for food and for the regional industry. Unfortunately, this species belongs to the list of overexploited animals from IBAMA and is in danger of disappearing due to fishing exploitation and to its reproductive difficulties, especially in captivity. For these reasons, we developed this project for the cloning and characterization of one of its hormones of reproduction (gonadotropins), namely luteinizing hormone (LH). This glycoprotein is formed by two subunits non-covalently bound: the α subunit (GTHα), in common with follicle-stimulating hormone (FSH) and the β subunit, that provides the specificity of its biological action. Both cDNAs of ag-GTHα and of ag-LHβ have been synthesized via reverse transcriptase (RT) and polymerase chain reaction (PCR) utilizing several primers, starting from total RNA extracted from A. gigas pituitary glands. The cDNA of ag-GTHα showed a total lenght of 767 bp, including a poli-A tail with 20 adenines. A coding reagion (ORF) of 348 bp, was also identified, starting from the first codon (ATG) at position 58, with the stop codon at position 403. The polyadenylation signal (ATTAAA) was identified 18 bp before the poly-A tail. This coding sequence translates a 115 amino acid peptide showing a signal-peptide cleavage site between amino acid 24 and 25. It has therefore a putative signal peptide with 24 and a mature peptide with 91 amino acids that, when aligned with other species of fish, presents 10 conserved residues of cysteine, 3 of proline and two potential glycosylation sites at amino acids 51-53 (NIT) and amino acids 77-79 (NHT). The cDNA of ag-LHβ has instead a total length of 711 bp, including a poly-A tail of 18 adenines. A coding region of 426 bp was identified, starting with the first codon (ATG) at position 47 and having the stop codon at position 469. The polyadenylation signal (AATAAA) was found 18 bp before the poly-A tail. The coding region translates a signal-peptide located between amino acid 24 and 25. It has a signal peptide with 24 and a mature peptide with 117 amino acids that presents 12 conserved residues of cysteine, 6 of proline and a potential N-glycosylation site at amino acid 10-12 (NQT), while a second possible N-glycosilation site at amino acid 27-29 (altered into QTT), was last due to the substitution of an asparagine with a glutamine. As for the case of ag-GTHα, the highest percent of identity was found with Cypriniformes (75.6%), while the lowest was with Gadiformes (53.8%). The phylogenetic analysis carried out with cDNA sequences of LHβ and FSHβ of 41 different fish species, confirmed previous published data concerning ag-GTHα, locating A.gigas as the sister group of Clupeocephala and the Elopomorpha (Anguilliformes) as the most basal group of all living teleosts.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22062015-143247 |
| Date | 22 April 2015 |
| Creators | Sevilhano, Thais Cristina dos Anjos |
| Contributors | Bartolini, Paolo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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