Protein kinase B (PKB), a serine threonine kinase, is highly involved in the regulation of cellular proliferation and survival. To characterize PKB’s function in lymphocyte development and activation, transgenic (tg) mice that express a membrane targeted constitutively active form of PKBa (myr PKB) in T and B cells were analysed. Thymocytes from myr PKB tg mice showed enhanced proliferation after T cell receptor (TCR) engagement compared to wild type (wt) mice. Astonishingly, myr PKB tg thymocytes were capable to proliferate in response to PMA only and were also less sensitive to inhibition by the calcineurin inhibitors CsA or FK506, which indicates the proliferative response of myr PKB tg T cells is relatively independent of calcium mobilisation and calcineurin activity. In addition, when TCR signalling was inhibited by the MEKinase inhibitor PD98059 or the Srckinase inhibitor PP1 myr PKB tg thymocytes again were more resistant to inhibition. Western blot analysis revealed myr PKB enhances activation of the kinases Lck, Raf and Erk after TCR/CD3 stimulation. Thus, myr PKB renders proliferative responses of thymocytes more sensitive to TCR signals by positive regulation of the Lck-Raf-MEK-Erk signalling pathway. Studies on the cellular location of the tg protein showed myr PKB is located in membrane socalled “lipid rafts”. Furthermore, we found that after TCR/CD3 ligation endogenous cytoplasmic PKB moves into “lipid rafts”, which highlights PKB as a crucial mediator of TCR proximal signalling events. Analysing three different TCR tg model systems for positive and negative selection of immature precursors in the thymus, we found myr PKB promotes positive selection of CD4+ but not CD8+ T cells. This most likely results from PKB’s positive cross-talk on Lck-Raf-Erk signalling, which is known to influence thymocyte selection and CD4/CD8-lineage choice. Furthermore, myr PKB enhances phosphorylation of glycogen synthase kinase 3 (GSK3), a negative regulator of the transcription factor NFAT (nuclear factor of activated T cells) and T cell activation, and of the adapter protein c-Cbl. Concerning negative selection, myr PKB enhanced (OT1 mice), reduced (HY mice) or had no influence (OT2 mice) on negative selection. Thus, myr PKB’s effect on negative selection strongly depends on the model system analysed and this most likely results from differences in TCR affinity/avidity and TCR specificity for MHC. 106 Peripheral CD4+ T cells from myr PKB tg mice showed enhanced production of both Th1 and Th2 cytokines. Furthermore, after TCR/CD3 stimulation in the presence of TGF-b1, wt CD4+ T cells showed a drastic inhibition of proliferation, whereas myr PKB tg CD4+ T cells proliferated even better, i.e. they were resistant to the inhibitory TGF-b1 signals. Expression of myr PKB in B cells leads to reduced Ca2+ flux and proliferation after BCR stimulation, but activation of Lyn, SLP-65, c-Cbl and GSK-3 were enhanced. When we analysed B cell subsets in myr PKB tg mice, a decrease in immature and mature B cells became obvious, whereas cell numbers for marginal zone (MZ) B cells were normal. In aged myr PKB tg mice we detected a very strong reduction of pro/pre and immature B cell populations in the bone marrow, indicating PKB is very important for maintenance of B cell development. Furthermore, myr PKB also lead to a strong reduction of peritoneal B-1 cells. However, expression of NFATc1, which is required for B-1 cell development, was comparable between wt and myr PKB tg B-1 cells. To analyse the effect of myr PKB on immunoglobulin production, mice were immunized with thymus dependent (TD) and independent (TI) antigens. In both cases, B cell responses were strongly elevated in myr PKB tg mice. Finally, RT-PCR analyses of in vitro expanded B cells revealed increased Blimp-1 and Notch3 expression in myr PKB tg B cells, which might be primary candidates involved in their enhanced effector function. In summary, this study clearly shows an important cross-talk between PKB and various critical signalling molecules downstream of the TCR and BCR. Thereby active PKB modulates and regulates the thresholds for thymocyte selection and T cell activation as well as for B cell development and function. / Proteinkinase B (PKB), eine Serin-Threonin Kinase, spielt bei der Regulation der Proliferation und des Überlebens vieler Zelltypen eine wichtige Rolle ein. Um die Funktion von PKB bei der Reifung und Aktivierung von Lymphozyten zu verstehen, wurden transgene (tg) Mäuse analysiert, die eine konstitutiv-aktive, myristoylierte Form der PKBa (myr PKB) in der T- und B-Zelllinie exprimieren. Thymozyten von myr PKB tg Mäusen zeigten im Vergleich zu wildtypischen (wt) Mäusen nach T-Zell-Rezeptor (TZR)-Stimulation eine deutlich erhöhte Proliferation. Myr PKB tg Thymozyten konnten zudem nur durch PMA zur Proliferation angeregt werden und waren auch weniger sensitiv gegenüber Inhibition durch die Calcineurin-Inhibitoren CsA und FK506. Dies weist darauf hin, dass die Aktivierung von T Zellen der myr PKB tg Mäuse relativ unabhängig von der Calcium-Mobilisierung und der Calcineurin-Aktivität ist. Wurde die TZR-Signalübertragung durch MEKinase-Inhibitor PD98059 oder den Src-Kinase- Inhibitor PP1 blockiert, so waren myr PKB tg Thymozyten wiederum sehr viel schlechter inhibierbar als wt Thymoyzten. Western-Blot-Analysen zeigten sodann, dass myr PKB nach TZR/CD3-Stimulation die Aktivierung der Kinasen Lck, Raf und Erk verstärkt. Somit führt aktive PKB über die positive Regulation des Lck-Raf-Mek-Erk Signalwegs zu einer erhöhten TZR-Sensitivität. Weiterhin verstärkt myr PKB die Phosporylierung der Glykogen Synthase Kinase 3 (GSK3), ein negativer Regulator des Transkriptionsfaktors NFAT (Nucleärer Faktor Aktivierter TZellen) und der T-Zell-Aktivierung sowie des Adaptorproteins c-Cbl. Unsere Untersuchungen zur zellulären Lokalisation von myr PKB ergaben, dass myr PKB in den sog. „lipid rafts“ der Membran lokalisiert ist. Weiterhin konnten wir zeigen, dass endogene cytoplasmatische PKB nach TZR/CD3-Stimulation in diese „lipid rafts“ wandert. Diese Daten weisen auf eine profunde Rolle von aktiver PKB bei der frühen und proximalen TZR-Signalübertragung hin. Die Analysen drei verschiedener TZR-tg Modellsysteme zur Selektion von unreifen TZellvorläufern im Thymus zeigten, dass myr PKB die positive Selektion von CD4+ aber nicht von CD8+ T-Zellen fördert. Dies resultiert sehr wahrscheinlich aus der positiven Regulation des Lck-Raf-Erk Signalweges, welcher ein zentraler Regulator der Thymozytenselektion und CD4/CD8-Linienentscheidung ist. Was den Einfluss von myr PKB auf die negative Selektion 108 betrifft, so verstärkte (OT1-Mäuse), verminderte (HY-Mäuse) oder hatte diese keinen Effekt (OT2-Mäuse). Die Effekte von myr PKB auf die negative Selektion sind daher stark abhängig vom Modellsystem, d.h. von der TZR-Affinität/Avidität und der Spezifität der TZRs für MHC-Moleküle. Periphere CD4+ T-Zellen von myr PKB tg Mäusen wiesen eine erhöhte Produktion von sowohl Th1- als auch Th2-Cytokinen auf. Erstaunlicherweise führte TZR/CD3-Stimulation in Anwesenheit von inhibitorischen TGF-b1-Signalen, ganz im Gegensatz zu wt T-Zellen, in myr PKB tg CD4+ T Zellen zu keiner Inhibition der Expansion, sondern sie proliferierten sogar stärker. Dies könnte mit der beobachteten erhöhten Zytokinproduktion von IL-2 und IFNg und/oder der erhöhten Phosphorylierung der Smad2/3 Proteine in myr PKB tg CD4+ T Zellen in Verbindung stehen. Die Expression von myr PKB in B-Zellen führte zu reduziertem Calcium-Flux und reduzierter Proliferation, wobei jedoch eine verstärkte Aktivierung von Lyn, SLP-65, c-Cbl und GSK-3 nachgewiesen werden konnte. Die Analyse der B-Zell-Populationen der myr PKB tg Mäuse zeigte eine Abnahme der unreifen und reifen B-Zellen in der Milz, jedoch war die Anzahl der Marginalzonen (MZ)-B-Zellen normal. Interessanterweise führte myr PKB zu einer sehr starken Reduktion peritonealer B-1-Zellen. Die Expression von NFATc1, welcher für die Entwicklung von B-1-Zellen benötig wird, war jedoch in den B-1-Zellpopulationen von wt und myr PKB tg Mäusen durchaus vergleichbar. Ältere myr PKB tg Mäuse zeigten einen starken Verlust der pro-/prä- und unreifen B-Zellen des Knochenmarks. Dies weist stark darauf hin, dass PKB für die Aufrechterhaltung der BZellentwicklung entscheidend ist. Darüber hinaus war, obgleich reduzierter B-Zellen, die Immunantwort auf Thymus-abhängige (TD) und –unabhängige (TI) Antigene in myr PKB tg Mäusen verstärkt. In RT-PCR Analysen von in vitro expandierten B-Zellen wurde sodann eine erhöhte Expression von Blimp-1 und Notch3 beobachtet, die zu der erhöhten Immunglobulin-Produktion der myrPKB tg B-Zellen beisteuern könnte. Zusammenfassend zeigen diese Arbeiten, dass aktive PKB die Expression/Aktivität zahlreicher wichtiger Signalmoleküle der TZR- und BZR-induzierten Signalleitung reguliert und somit die Schwellenwerte für die Selektion und Aktivierung von T-Zellen sowie für die Entwicklung und Funktion von B-Zellen entscheidend moduliert.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:1158 |
| Date | January 2005 |
| Creators | Na, Shin-Young |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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