Die Expression der Hämatopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre“ Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des hämatopoetischen Systems beschränkt. Die HPK1 wurde ursprünglich als ein Aktivator des JNK-Signalübertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und kürzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. Für die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine mögliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signalübertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signalübertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die Förderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Homöostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale Überexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) führte. Die Expression einer HPK1-„antisense“ (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgeprägt, in denen die Überexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verstärkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen führt die HPK1-Expression zu einer verstärkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die Überexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen führte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In Übereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivität durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse führten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: während der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signalübertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es später zur Inhibierung der NFkB-Aktivität und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den Überlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verständnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukleären Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) gehören zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminosäuren (aa) große DNA-Bindedomäne und eine Calcineurin-Bindedomäne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. über die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h führt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der längeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion primärer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst lässt. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu üben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus. / Hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1) is a member of germinal center kinases that is predominantly expressed in hematopoietic cells. The HPK1 has originally been described as an upstream Ser/Thr protein kinase of the JNK signaling cascade [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996]. Recently, it was shown that T cell receptor (TCR) stimulation leads to a rapid but transient activation of HPK1 and its binding to the linker of activated T cells (LAT) and the adaptor proteins Nck, Crk and Gads. HPK1 which also binds to the signaling molecules SLP-76, Grb2, Grap and CrkL is localized in lipid rafts and needs lck and ZAP70 for its activation [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. These data suggested an involvement of HPK1 in the signaling transfer from the TCR to downstream signaling cascades. However, a role for HPK1 in T cell physiology remained to be shown. We show here that one of the functions of HPK1 activation upon T cell stimulation is to control the termination of immune response and, therefore, homeostasis of the immune system by supporting the ´Activation Induced Cell Death´ (AICD) of T cells. This is demonstrated by overexpressing wild type (wt) HPK1 which led to a substantial increase in spontaneous and antiCD3-mediated apoptosis as well as in Fas ligand (FasL or also CD95L) expression on murine CD4+ T cells. In contrast, expression of HPK1 antisense (AS)-RNA exerted a slight, albeit measurable suppressive effect on both apoptosis and FasL expression. Apoptosis suppression by overexpressing HPK1 AS-RNA was much more pronounced in H2O2-treated EL-4 T cells in which HPK1 overexpression stimulated cell death induced by reactive oxygen species (ROS) indicating that HPK1 indeed controls apoptosis in T cells. HPK1 expression also led to a sustained increase in c-Jun N-terminal kinase (JNK) activity suggesting that JNK activation contributes to the HPK1-mediated apoptosis in H202-treated EL-4 cells. Under the same conditions a rapid cleavage of HPK1 was observed, and overexpression of N- and C-terminal cleavage products in CD4+ T cells resulted, similar to full-length HPK1, in an increase in AICD. In agreement with published data we show that the C-terminal portion of HPK1 suppresses IkBalpha degradation thereby inhibiting NFkB activation. Taken together, these results led to a model in which, during the initial phase of T cell activation, the rapid and transient HPK1 induction provides both pro- and anti-apoptotic signals by activating JNK and NFkB signaling pathways, respectively. At a later stage, due to the accumulation of the C-terminal HPK1 cleavage product, NFkB activation is suppressed and the balance between survival and apototic signals is shifted favoring apoptosis. However, signalling events in addition to the stimulation of JNK and inhibition of NFkB signalling cascades might also be involved in the HPK1-mediated control of T cell apoptosis. The nature of these events remains to be elucidated. Nuclear Factor of activated T cells (NFAT) proteins belong to a family of transcription factors which share a common DNA binding domain of approximately 300 amino acids (aa) and a calcineurin binding domain. NFATc (also designated as NFATc1 or NFAT2) and NFATp (also designated as NFATc2 or NFAT1) are highly expressed in peripheral T cells and control their effector function, in particular the expression of lymphokines, such as IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 and IFNgamma. Further target promoters for NFATs are the p21Waf1, the CD40 ligand and CD95 ligand promoters indicating that in addition to effector function NFATs are also involved in the control of the cell cycle and, in particular, AICD of T lymphocytes. We have shown previously that T cell activation leads to the massive induction of the short isoform A of NFATc within 3-4 h [Chuvpilo et al., 1999b], i.e. before the onset of AICD. This observation suggested that due to the lack of the C-terminal extension of approximately 245 aa which is present in all other NFAT proteins, NFATc/A might differ in biological function from other NFAT proteins, including its longer isoform NFATc/C. This view prompted us to investigate the induction and function of NFATc/A in murine T lymphocytes. Here we show that infection of primary CD4+ T lymphocytes with recombinant retroviruses expressing NFATc/A, in contrast to retroviruses expressing NFATc/C or NFATp, does not enhance AICD. These data suggest that the massive synthesis of NFATc/A upon activation of effector T cells ensures these cells to exert effector functions without inducing rapid apoptosis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:259 |
| Date | January 2002 |
| Creators | Schulze-Lührmann, Jan |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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