La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en
évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux
membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces
radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome.
D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est
possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous
avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par
la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour
empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont
démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires
dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre
au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose.
Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux
lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de
masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis
d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances
cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse
plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles
augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos
résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome
et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus,
en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons
constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui
dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées. / Macrophages are specialized cells of the immune system which mediate destruction
and killing of invading micro-organisms. They do so by engulfing them by a process
called phagocytosis. Microbes are then captured in an intracellular compartment, the
phagosome, which gradually acquire molecules able to attack and degrade its cargo.
Use of proteomics let us demonstrate the presence of flotillin-1 enriched
microdomains (also called lipid rafts or membrane rafts) on the phagosomes. Our team
demonstrated the crucial importance of these rafts in the phagocytosis process. Indeed,
survival of L. donovani correlates with its presence in a ‘raftless’ phagosome while a
mutated L. donovani without LPG is rapidly killed in a phagosome containing lipid
rafts.
To understand the membrane raft destabilisation mechanism mediated the LPG
molecule, we induced phagocytosis of parasites devoid of LPG (LPG-) and compared
it to the wild type parasite by microscopy. We first demonstrated that LPG alone is
necessary to prevent normal maturation of the phagosome. Additionally, we
discovered that the LPG molecule not only inhibits lipid rafts formation on the
phagosome but also disorganise pre-existing lipid rafts. This effect of LPG is
proportional to the number of repetitive sugar units (Gal( 1,4)-Man 1-PO4) which
compose this molecule. Our work demonstrated for the first time an important role of
the membrane rafts in the phagosome maturation. Moreover, our conclusions will give
new interesting leads for clinical studies on leishmaniosis.
The second goal of this work was to characterise them with proteomics and lipidomics
tools. To do this, we undertook the systematic identification of proteins present on
both subdomains of the phagosome (lipid rafts versus the rest of the phagosomal
membrane). To achieve this, we purified phagosomes, from which we isolated lipid
rafts by floating Triton X-100 insoluble membranes (DRMs for Detergent Insoluble
Membranes). After that, we identified proteins by mass spectrometry.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/3585 |
| Date | 04 1900 |
| Creators | Goyette, Guillaume |
| Contributors | Desjardins, Michel |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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