Glyphosat ist eines der weltweit am häufigsten eingesetzten Herbizide. Sein Einsatz wird u.a. auf Grund einer möglichen karzinogenen Wirkung und eines möglichen negativen Einflusses auf die Biodiversität kritisch diskutiert. Um Aussagen über die Verbreitung von Glyphosat in der Umwelt treffen zu können, werden verlässliche Nachweissysteme benötigt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, ein einfaches optisches System zum schnellen Nachweis von Glyphosat in wässrigen Proben, basierend auf einer Hydrophobin-funktionalisierten Oberfläche, die das Glyphosat Zielprotein präsentiert, zu entwickeln. Hierfür wurden verschiedene Fusionsproteine aus dem Glyphosat Zielprotein, der 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS, hier aus dem Bakterium Escherichia coli (EcEPSPS)) und dem zur Selbstassemblierung an hydrophilen/hydrophoben Grenzflächen befähigten Hydrophobin Ccg2 aus Neurospora crassa erzeugt, welche für die Oberflächenfunktionalisierung eingesetzt wurden. Die Expression und Reinigung der Fusionsproteine und von Ccg2 in E. coli verlief erfolgreich. Nach initialen Kontaktwinkelmessungen zur Untersuchung der Funktionalität des Hydrophobins und Enzymaktivitätsmessungen für die Fusionsproteine, konnte deren Aktivität auch nach der Reinigung nachgewiesen werden. Dabei erwies sich das Fusionsprotein Ccg2_GS_EcEPSPS, aufgrund einer hohen enzymatischen Aktivität nach Immobilisierung, als am besten geeignet. Es wurden verschiedene Belegverhältnisse zwischen Hydrophobin und Fusionsprotein untersucht, um etwaige sterische Behinderungen zu minimieren. Hierbei erwies sich ein Belegverhältnis von 1 µM Ccg2_GS_EcEPSPS und 5 µM Ccg2 für die künftigen Messungen als gut geeignet. Auf Basis der so funktionalisierten Oberfläche wurden zwei Verfahren zum optischen Nachweis von Glyphosat entwickelt. Eines der Verfahren, der Malachitgrün-Assay, weist die enzymatische Aktivität der EPSPS auf der Oberfläche nach, genauer das entstehende anorganische Phosphat (Pi). Durch Glyphosathemmung entsteht weniger Pi, dies kann mittels Malachitgrün-Assay nachgewiesen werden. Unter Laborbedingungen konnte ein Detektionslimit von 50 nM erreicht werden. Des Weiteren zeigte der Assay keine nennenswerte Querempfindlichkeit und erwies sich damit als sehr spezifisch. Zusätzlich wurde der Einfluss unterschiedlicher Temperaturen und pH-Werte untersucht. Es zeigte sich, dass Schwankungen dieser Parameter den Assay beeinflussen. Auch ein Einfluss der Ionenstärke konnte festgestellt werden. Deshalb sind entsprechende Kontrollen unerlässlich. Der Einfluss nicht-reaktionsbedingten Phosphates konnte durch Vorinkubation der Oberfläche mit der Glyphosat-haltigen Analyselösung mit anschließender Entfernung der Selbigen und Durchführung des Malachitgrün-Assays minimiert werden. Das zweite Verfahren, der Hydrogelsonden (HGS)-Assay, weist direkt die Interaktion von Glyphosat und der immobilisierten EcEPSPS nach. Hierfür wurden verformbare, Glyphosat-dekorierte HGS aus Polyethylenglykol benötigt. Bei Abwesenheit von freiem Glyphosat liegen die Bindestellen der immobilisierten EPSPS frei vor, sodass sie für die Bindung des immobilisierten Glyphosats an den HGS zur Verfügung stehen. Zwischen den HGS und der Oberfläche entsteht auf diese Weise eine große Kontaktfläche, welche mittels Reflektionsinterferenzkontrastmikroksopie messbar ist. Freies Glyphosat in der Analyselösung reduziert die verfügbaren Bindestellen an der Oberfläche. Dies resultiert in einer kleineren Kontaktfläche. Auf diese Weise kann durch Ermittlung der Größe der Kontaktfläche zwischen HGS und funktionalisierter Oberfläche und der daraus berechneten Adhäsionsenergie, auf das Vorhandensein von Glyphosat in der Analyselösung geschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nach Optimierung der Oberflächenbeschichtung, ein positiver Machbarkeitsbeweis für dieses Verfahren erbracht werden.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:74129 |
| Date | 08 March 2021 |
| Creators | Döring, Julia |
| Contributors | Rödel, Gerhard, Pompe, Tilo, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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