A utilização de toxinas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) no controle de lepidópteros-praga, principalmente em áreas onde a estratégia de refúgio não é regulamentada, facilita a evolução da resistência em populações de pragas-alvo. Há três relatos de resistência à campo para Spodoptera frugiperda (J.E. Smith), dois para a toxina Cry1F e um para Cry1Ab. No Brasil, ocorrem populações resistentes à Cry1F e Cry1Ab. Esse trabalho foi voltado à identificação do mecanismo de resistência de uma população de S. frugiperda à toxina Cry1F, baseando-se nas hipóteses existentes para explicar o modo de ação de toxinas Cry. Uma dessas hipóteses é baseada na formação de poros na membrana do epitélio intestinal, enquanto a outra na transdução de sinal intracelular e ativação do processo de morte celular. Para a identificação do mecanismo de resistência de S. frugiperda à toxina Cry1F, o receptor caderina de linhagens suscetível (SUS) e resistente (RES) foi caracterizado, bem como realizado estudos de expressão gênica diferencial comparativa pela análise do transcritoma dessas linhagens. Estudos de expressão gênica diferencial comparativa também foram realizados pela análise do transcritoma do intestino de lagartas de linhagens SUS e resistente isogênica (RESiso), para a identificação do mecanismo molecular de resistência à toxina Cry1F. A caracterização do transcrito do gene caderina das linhagens suscetível, resistente e resistente isogênica revelou diferenças na composição de aminoácidos da proteína caderina predita entre as linhagens suscetível e resistente à toxina Cry1F nos domínios de repetição CR5, CR6 e CR10 e no domínio C-terminal. Também foi verificado que das mutações encontradas na linhagem RES, apenas as mutações da região C-terminal foram fixadas na linhagem RESiso. A análise comparativa do transcritoma de linhagens SUS e RES indicou a maior expressão de genes relacionados à metabolização de xenobióticos, como as monoxigenases do citocromo P450, glutationa-S-transferases e carboxilcolinesterases, em lagartas resistentes, mas não foram encontradas diferenças na expressão de receptores Cry, como aminopeptidase N e fosfatase alcalina. Porém, caderina foi superexpressa e o transportador ABCg5 teve expressão reduzida na linhagem RES. O ABCg5 foi indicado como o provável mecanismo de resistência dessa linhagem à toxina Cry1F, juntamente com o aumento da capacidade de detoxificação relatada. A análise comparativa do transcritoma de linhagens SUS e RESiso produziu resultados semelhantes à análise anterior quanto ao padrão de expressão de enzimas de detoxificação, mas nesse caso foi observada redução da transcrição de caderina na linhagem RESiso em relação à SUS. A análise da linhagem isogênica também indicou alteração na expressão de transportadores ABC na linhagem RESiso; porém, para o transportador ABCb1. A análise comparativa do transcritoma de linhagens SUS e RESiso corroborou a participação do sistema de detoxificação e acrescentou a redução na expressão do receptor caderina como mecanismo de resistência dessa população à toxina Cry1F, assim como a de transportadores ABC, apesar do transportador ABCg5 não ter sido identificado nessa análise comparativa. / The broad use of Cry toxins from Bacillus thuringiensis (Bt) to control lepidopteran pests, particularly where refuge strategies are not legalized or implemented, has facilitated the evolution of resistance of pest populations. There are three records of resistance of Spodoptera frugiperda (J.E Smith) in field condition to Bt toxins so far, two of them to Cry1F and one to Cry1Ab toxins. In Brazil, field-evolved resistance of S. frugiperda has been recorded for both toxins. Thus, we aimed to identify the mechanisms associated to the resistance of S. frugiperda to Cry1F toxin based on the two concurrent hypotheses on the mode of action of Cry toxins. One of such hypotheses is based on the potential of Cry toxins to form pores in the membrane of the gut epithelium, while the other is based on the production of an intracellular transduction signal and the activation of the process of cell death. To identify the resistance mechanisms of S. frugiperda to Cry1F toxin, we characterized the transcript of the cadherin receptor of susceptible (SUS) and resistant (RES) strains of S. frugiperda to search for mutations and performed a comparative analysis of the transcriptome from SUS and RES strains. We also analyzed the transcriptome from the gut of SUS and isogenic resistant strains (RESiso) in order to identify the molecular mechanisms associated to the resistance of S. frugiperda to Cry1F. The characterization of cadherin receptor in SUS, Res and REsiso strains showed differences in the amino acid composition of the repeated domains CR5, CR6 and CR10 and in the C-terminal domain. Only mutations occurring on C-terminal of the RES strain were maintained in the RESiso strain. The comparative transcriptome between SUS and RES strains indicated a higher expression of genes related to the detoxification process, such as cytochrome P450s, glutathione-S-transferases and carboxylcholinesterases in the RES strain, while no differences in the expression of Cry receptors, such aminopeptidade N and alkaline phosphatase, were observed. However, transcriptomic analysis indicated up-regulation of cadherin and down-regulation of the ABCg5 transporter was down-regulated in the RES strain. We propose that ABCg5 is one of the mechanisms involved in S. frugiperda resistance to Cry1F, together with the increased detoxification activity observed. Analysis of the gut transcriptome from SUS and RESiso yielded similar results regarding the differential expression of detoxifying enzymes, but on this case cadherin was down-regulated in RESiso as compared to the SUS strain. Down-regulation of ABC transporters in the RESiso strain was also observed, but for the ABCb1 transporter. Analyses of the transcriptome of SUS and RESiso strains also indicated the resistance of S. frugiperda to Cry1F is related to an increased transcription of detoxifying enzymes and a reduced transcription of the cadherin receptor. Our data also demonstrates the resistance is due to the existence of adequate constitutive levels of transcription of genes that respond to the intoxication with Cry1F.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30092016-144506 |
| Date | 29 July 2016 |
| Creators | Domingues, Felipe Antônio |
| Contributors | Cônsoli, Fernando Luis |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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