Most animal cells adopt an approximately spherical shape when entering mitosis. This process has been termed mitotic rounding. It ensures the correct morphogenesis of the mitotic spindle and, in turn, successful cell division. When cells acquire a round shape at the entry of mitosis, they need to mechanically deform the surrounding tissue to do so. Previous studies suggest that the forces necessary for this deformation emerge from the contractility of the mitotic actin cortex. In fact, at the onset of mitosis, cortical contractility was found to be upregulated giving rise to an increased cell surface tension which drives the mitotic cell into a spherical shape.
In a growing tumor, an increasing cell density generates a compressive mechanical stress which would likely lead to an increasing mechanical obstacle for mitotic rounding. Indeed, mechanical confinement or external pressure have been shown to hamper cell proliferation in tumor spheroids. Thus, it has been hypothesized that the actin cortex of cancer cells exhibits oncogenic adaptations that allow for ongoing mitotic rounding and division inside tumors. In fact, it was shown that the human oncogene Ect2 contributes to mitotic rounding through RhoA activation and that Ras overexpression promotes mitotic rounding. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a cellular transformation in which epithelial cells loose epithelial polarity and intercellular adhesiveness gaining migratory potential. EMT, a hallmark in cancer progression, is commonly linked to early steps in metastasis promoting cancer cell invasiveness. Moreover, EMT was connected to cancer stem cells and the outgrowth of secondary tumors, suggesting that EMT may also be important for cell proliferation in a tumor.
In this work, I investigated the role of EMT in actin cortex mechanics and mitotic rounding. To assess cortex mechanics, I measured the mechanical properties of the actin cortex in mitosis, in particular cortical stiffness and contractility before and after EMT. Furthermore, I also determined the mechanical changes of the actin cortex of interphase cells upon EMT; mechanics of interphase cells may critically influence mitotic rounding as interphase cells are a major constituent of the surrounding of a mitotic cell which needs to be deformed in the process of rounding. For our cortex-mechanical measurements, I used an established dynamic cell confinement assay based on atomic force microscopy. I show striking cortex- mechanical changes upon EMT that are opposite in interphase and mitosis. They are accompanied by a strong change in the activity of the actomyosin master regulators Rac1 and RhoA. Concomitantly, I characterize cortex-mechanical changes induced by Rac1 and RhoA signaling. In particular, I show that Rac1 inhibition restores epithelial cortex mechanics in post-EMT cells. Furthermore, I give evidence that EMT, as well as Rac1 activity changes induce actual changes in mitotic rounding in spheroids embedded in mechanically confining, covalently crosslinked hydrogels. Overall, I give evidence that EMT-induced changes results in a softer and less contractile cortex in interphase and a stiffer and more contractile cortex in mitotic cells, and it correlates with increased proliferation in confined environment.:Summary
Zusammenfassung
Acknowledgements
1-Introduction
1.1-The actin cortex
1.1.1-Regulation of actin cortex polymerization
1.1.2-Rho-GTPases in actin cortex regulation
1.1.3-The actin cortex in cell shape regulation and mitotic rounding
1.1.4-Experimental approaches to measure actin cortex mechanics
1.1.5-AFM cell confinement assay – a new tool for actin cortex-mechanical measurements
1.2-Epithelial-mesenchymal transition in cancer progression and metastasis
1.2.1-EMT effects on cell proliferation
1.2.2-EMT effects on Rho-GTPases activities
1.2.3-EMT effects on transcription factors
1.3-Outline of the thesis
2-Pharmacological induction of EMT
3-Mechanical changes of actin cortex mechanics upon EMT
3.1-Cell volume change during AFM confinement
3.2-Interphase and mitotic actin cortex mechanical changes upon EMT
3.3- Rho-GTPases activity changes upon EMT
4- Molecular perturbations of the cortex and their impact on cortex mechanics
5-Mitotic rounding in confined cell spheroids before and after EMT
5.1-The effect of cortex regulators on confined spheroids upon EMT
6-Time-dependence of actin cortex mechanics in breast epithelial cells
6.1-Rheology of actin cortex as a thin active film
6.2-Viscoelasticity of the actin cortex in relation to malignancy
7-Discussion
8-Outlook
8.1-Mitosis duration and quiescence in confined spheroids
8.2-Signalling cascades that trigger EMT-induced cortex-mechanical phenotype
8.2-Membrane tension upon EMT
9-Bibliography
10-Appendix
10.1-Abbreviations
10.2-Symbols / Die meisten tierischen Zellen nehmen beim Eintritt in die Mitose eine annähernd kugelförmige Form an. Dieser Vorgang wird als mitotische Aufrundung bezeichnet. Sie sorgt für die korrekte Morphogenese der mitotischen Spindel und damit für eine erfolgreiche Zellteilung. Wenn Zellen beim Eintritt der Mitose eine runde Form annehmen, müssen sie das umgebende Gewebe mechanisch verformen. Frühere Studien legen nahe, dass die für diese Verformung erforderlichen Kräfte aus der Kontraktilität des mitotischen Aktin-Cortexes resultieren; zu Beginn der Mitose führt ein Anstieg der kortikalen Kontraktilität zu einer erhöhten Zelloberflächenspannung, die die mitotische Zelle in eine kugelförmige Form treibt.
Bei einem wachsenden Tumor erzeugt eine zunehmende Zelldichte einen Kompressionsdruck, der vermutlich ein zunehmendes mechanisches Hindernis für die mitotische Aufrundung darstellt. Es wurde gezeigt, dass mechanische Begrenzung oder äußerer Druck die Zellproliferation in Tumorsphäroiden hemmen. Es wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass der Aktinkortex von Krebszellen onkogene Anpassungen aufweist, die eine fortlaufende mitotische Aufrundung und Zellteilung innerhalb von Tumoren ermöglichen. Weiterhin wurde gezeigt, dass das humane Onkogen Ect2 durch RhoA-Aktivierung zur mitotischen Aufrundung beiträgt und dass die Überexpression von Ras die mitotische Aufrundung fördert.
Die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) ist eine zelluläre Transformation, bei der Epithelzellen die epitheliale Polarität und die interzelluläre Adhäsivität verlieren und Migrationspotential gewinnen. EMT, ein Kennzeichen für das Fortschreiten von Krebs, ist häufig mit frühen Schritten der Metastasierung und einer Steigerung der Invasivität von Krebszellen verbunden. Darüber hinaus wird die EMT mit Krebsstammzellen und der Entstehung von Sekundärtumoren in Verbindung gebracht, was darauf hindeutet, dass die EMT auch für die Zellproliferation in einem Tumor wichtig sein könnte.
In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der EMT für die Mechanik des Aktinkortex und die mitotische Aufrundung untersucht. Die mechanischen Eigenschaften des Zellkortexes, insbesondere die kortikale Steifheit und Kontraktilität, wurden in mitotischen und nicht-adhärenten Interphasezellen gemessen vor und nach der EMT. Die Mechanik von Interphasenzellen kann die mitotische Aufrundung entscheidend beeinflussen, da Interphasenzellen ein Hauptbestandteil der Umgebung einer mitotischen Zelle sind, die während des Aufrundungsprozesses deformiert werden muss. Für meine kortexmechanischen Messungen verwendete ich einen etablierten Assay, der auf Rasterkraftmikroskopie basiert. Ich konnte ausgeprägte kortexmechanische Veränderungen durch die EMT feststellen, die in Interphase und Mitose entgegengesetzt sind. Diese kortikalen Veränderungen gehen mit einer starken Modifikation der Aktivitäten der Actomyosin-Hauptregulatoren Rac1 und RhoA einher. Weiterhin konnte ich kortexmechanische Veränderungen charakterisieren, die durch Rac1- und RhoA- Signale induziert werden. Insbesondere zeige ich, dass die Rac1-Hemmung die epitheliale Kortexmechanik in Post-EMT-Zellen wiederherstellt. Darüber hinaus fand ich Hinweise darauf, dass EMT- und Rac1-Aktivitätsänderungen zu einer Änderung der mitotischen Aufrundung in eingebetteten Sphäroiden führen. Insgesamt zeigen die Daten in dieser Arbeit klare Hinweise darauf, dass EMT-induzierte Veränderungen zu einem weicheren und weniger kontraktilen Kortex in der Interphase und einem steiferen und kontraktileren Kortex in mitotischen Zellen führen und mit einer erhöhten Proliferation in mechanisch begrenzten Zellumgebungen korrelieren.:Summary
Zusammenfassung
Acknowledgements
1-Introduction
1.1-The actin cortex
1.1.1-Regulation of actin cortex polymerization
1.1.2-Rho-GTPases in actin cortex regulation
1.1.3-The actin cortex in cell shape regulation and mitotic rounding
1.1.4-Experimental approaches to measure actin cortex mechanics
1.1.5-AFM cell confinement assay – a new tool for actin cortex-mechanical measurements
1.2-Epithelial-mesenchymal transition in cancer progression and metastasis
1.2.1-EMT effects on cell proliferation
1.2.2-EMT effects on Rho-GTPases activities
1.2.3-EMT effects on transcription factors
1.3-Outline of the thesis
2-Pharmacological induction of EMT
3-Mechanical changes of actin cortex mechanics upon EMT
3.1-Cell volume change during AFM confinement
3.2-Interphase and mitotic actin cortex mechanical changes upon EMT
3.3- Rho-GTPases activity changes upon EMT
4- Molecular perturbations of the cortex and their impact on cortex mechanics
5-Mitotic rounding in confined cell spheroids before and after EMT
5.1-The effect of cortex regulators on confined spheroids upon EMT
6-Time-dependence of actin cortex mechanics in breast epithelial cells
6.1-Rheology of actin cortex as a thin active film
6.2-Viscoelasticity of the actin cortex in relation to malignancy
7-Discussion
8-Outlook
8.1-Mitosis duration and quiescence in confined spheroids
8.2-Signalling cascades that trigger EMT-induced cortex-mechanical phenotype
8.2-Membrane tension upon EMT
9-Bibliography
10-Appendix
10.1-Abbreviations
10.2-Symbols
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:73915 |
| Date | 17 February 2021 |
| Creators | Hosseini, Kamran |
| Contributors | Fischer-Friedrich, Elisabeth, Diez, Stefan, Fahmy, Karim, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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