Strict regulation of cell growth, apoptosis and differentiation is essential for normal kidney development. The expression and activation of the Ste20-like kinase, SLK, is increased during renal development and recovery from ischemic acute renal failure, which recapitulates certain aspects of kidney development. SLK promotes apoptosis and may, therefore, regulate cell growth during development and healing. We propose that activation of SLK may be due to upregulation of expression, which may then favor homodimerization and/or reversal of autoinhibition. To test this hypothesis, the cDNA encoding the SLK catalytic domain (amino acids 1-373) was fused with a cDNA for a modified FK506 binding protein, Fv2E (Fv2E-SLK(1-373)). The plasmid was transfected into COS-1 cells, and a fusion protein of the expected molecular mass was expressed. Addition of AP20187 (an analog of FK506) induced dimerization of Fv2E-SLK(1-373). In an in vitro immune complex kinase assay, the dimeric Fv2E-SLK(1-373) displayed 1.7 fold greater activity, compared with the monomer. Glomerular epithelial cells were transiently transfected with Fv2E-SLK(1-373) and were treated with or without AP20187. Compared with the monomer, dimeric SLK(1-373) increased activation- specific phosphorylation of c-Jun N-terminal kinase and p38 kinase (1.5-2.1 fold) reflecting enhanced signaling via stress kinase pathways. In a second assay of SLK signaling, we monitored p53 transactivation following transient transfection of a luciferase reporter plasmid that contains a p53 cis-acting enhancer element. Addition of AP20187 to cells transfected with Fv2E-SLK(1-373) enhanced p53 reporter activity, compared with untreated. Finally, we monitored the effect of SLK dimerization on the activation of the proapoptotic protein, Bax. Cells were cotransfected with Fv2E-SLK(1- 373) and Bax-luciferase reporter cDNAs. Stimulation of the Bax reporter by SLK was 2.5 fold in the presence of AP20187 and 1.8 fold in / La régulation de la croissance cellulaire, de l'apoptose et de la différentiation cellulaire sont essentielles pour le développement rénal. L'expression et l'activation de la protéine kinase SLK (« Ste20-like kinase ») sont augmentés durant le développement rénal et la récupération d'une ischémie suite a un dommage rénal, qui en fait récapitule certains aspects du développement rénal. La kinase SLK peut promouvoir la mort cellulaire et pourrait être impliquée dans la régulation de la croissance durant le développement et le processus de guérison. Nous proposons que l'activation de la kinase SLK soit due à l'augmentation de son expression favorisant ainsi son homodimérisation et/ou le déblocage de son auto-inhibition. Pour tester cette hypothèse l'ADN complémentaire (ADNc) codant pour le domaine catalytique de SLK (acides aminés 1-373) a été fusionné avec un ADNc codant pour une version modifiée de la protéine de liaison FK506, appelée Fv2E. La construction résultante, Fv2E-SLK (1-373), a été transfectée dans des cellules COS-1 pour exprimer la protéine fusion résultante. L'addition d'AP20187 (un analogue de FK506) peut ensuite induire la dimérisation de Fv2E-SLK (1-373). In vitro, le dimère Fv2E-SLK (1-373) montre une augmentation de son activité de 1.7 fois par rapport à la version monomère. Des cellules épithéliales glomérulaires ont ensuite été transfectées transitoirement avec la construction Fv2E-SLK (1-373) et traitées ou non avec l'AP20187. Comparée au monomère, la forme dimérique du Fv2E-SLK (1-373) augmente la phosphorylation de c-Jun N-terminal kinase et de la kinase p38 de 1.5 à 2.1 fois respectivement, reflétant ainsi une activation qui semble liée au stress. Dans une autre expérience visant à mesurer l'activité de SLK nous avons mesuré la transactivation de p53 suite a une transfection transitoire d'un plasmide rapporteur contenant l'élément de réponse cis de p53.$
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.86512 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Delarosa, Sierra |
| Contributors | Andrey V E Cybulsky (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Medicine) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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