O meduloblastoma (MB) é um tumor embrionário que se origina de alterações genéticas em vias importantes para neurôgenese do cerebelo como Sonic hedgehog (Shh) e Wingless (Wnt). Alterações específicas nessas vias permitem a classificação do MB pelo perfil de expressão e mutacional em quatro subgrupos: SHH, WNT, grupo 3 e grupo 4. A ativação dessas vias pode estar relacionada à hipermetilação de reguladores negativos. A dinâmica da hidroximetilação foi descrita durante o desenvolvimento cerebelar, mas não há relatos na literatura sobre os níveis da hidroximetilação em amostras de MB. Os principais objetivos desse trabalho foram: avaliar os níveis de expressão dos genes TETs e IDHs em MB por qPCR; investigar os níveis de hidroximetilação por meio de imuno-histoquímica e dot-blot; avaliar mutações no éxon 4 de IDH1 e IDH2 por sequenciamento; analisar a metilação e hidroximetilação em genes reguladores negativos das vias SHH, WNT, NOTCH, BMP; modular a atividade dos genes TETs por meio do ácido ascórbico e verificar sua influência funcional e epigenética. Foi observada diminuição na expressão dos genes TETs e IDHs em amostras de MB apenas em comparação com cerebelos fetais, mas não em relação aos cerebelos não-fetais. As linhagens celulares de MB apresentaram expressão diminuída em comparação aos dois grupos controles. A classificação das amostras de MB permitiu verificar uma expressão gênica subgrupo específica. A expressão de TET3 apresentou associação com status da doença; e maiores níveis de IDH2 foram associados à metástase. Não foram encontradas mutações no éxon 4 de IDH1, ou no éxon 4 de IDH2 em MB. Os níveis de hidroximetilação global estão diminuídos em amostras de MB e linhagens celulares em comparação aos cerebelos não-neoplásicos; porém não estão associados com características clínicas dos pacientes. Não foram encontrados níveis detectáveis de hidroximetilação nos genes estudados. Os efeitos do ácido ascórbico foram linhagem-específicos, não ocorreu aumento nos níveis de hidroximetilação, mas alterações na expressão do gene TET3. Em conclusão, níveis de hidroximetilação e expressão dos genes TETs e IDHs são importantes para o MB. No entanto, estudos funcionais direcionados à manipulação desses genes são necessários para elucidar suas funções nesse tumor. / Medulloblastoma (MB) is an embryonic tumor that originates from genetic alterations in pathways that are important to the neurogenesis of cerebellum, such as Sonic hedgehog (Shh) e Wingless (Wnt). These alterations allow us to classify MB based in expression and mutational profile in four subgroups: SHH, WNT, group 3 and group 4. The activation of these pathways could be related to hypermethylation of negative regulators. Hydroxymethylation dynamics was described during cerebellum development, but there are not reports in the literature about hydroxymethylation levels in MB samples. The main aims of this study were: to evaluate TET and IDH genes expression in MB using qPCR; to investigate hydroxymethylation levels using immunohistochemistry and dot-blot; to evaluate mutations in exon 4 of IDH1 and IDH2 genes through sequencing analysis; to analyze methylation and hydroxymethylation levels in genes that regulate SHH, WNT, NOTCH and BMP pathways; to modulate TET genes activity through ascorbic acid and verify its functional and epigenetic influence in MB cell lines. We observed a decrease in TET and IDH genes expression in MB samples compared to fetal cerebellum, but not according to non-fetal cerebellum. MB cell lines presented a decrease when compared to both control groups. The classification of MB samples allowed us to verify a subgroup-specific gene expression. TET3 expression was associated with disease status; and higher levels of IDH2 gene expression were associated with metastasis. We did not find mutations in exon 4 of IDH1 and exon 4 of IDH2 genes in MB samples. Hydroxymethylation levels were decreased in MB samples and cell lines when compared to non-neoplastic cerebellum; however, they were not associated with clinical characteristics of the patients. We did not detect hydroxymethylation levels in the studied genes. Ascorbic acid effects are cell linespecific: we did not observe increase in hydroxymethylation levels, but alterations in TET3 gene expression. In conclusion, hydroxymethylation and expression levels of TET and IDH genes are important for MB. Though, functional assays that target these genes are required to elucidate their function in MB.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18042018-104554 |
| Date | 15 September 2017 |
| Creators | Salomão, Karina Bezerra |
| Contributors | Tone, Luiz Gonzaga |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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