Neste trabalho foi utilizado um esquema multi-técnicas para estudar a base de interações moleculares protagonizadas por duas proteínas que possuem funções biológicas completamente distintas. A primeira delas, clorocatecol 1,2-dioxigenase (Pp 1,2-CCD), tem um apelo biotecnológico para área ambiental devido a sua capacidade de catalisar a degradação do composto clorocatecol, um intermediário comum no final da decomposição de diversos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Essa característica pode promover a descontaminação de solos e águas poluídos revelando um grande potencial para aplicações em mecanismos de biorremediação. Além disso, a presença de moléculas anfipáticas junto à interface de ligação dos monômeros da CCD levantou a questão em relação à capacidade dessa família de enzimas de se ligar a membranas biológicas. Esse tipo de informação amplia o conhecimento acerca de mecanismos básicos de ação da enzima, aumentando a possibilidade de parceiros de interação, podendo levar a outras formas de controle da atividade biológica para uso em aplicações biotecnológicas como desenvolvimento de biossensores. O estudo dessa enzima está, portanto, voltado para a compreensão de suas interações com miméticos de membrana e a tentativas de imobilização da proteína nestas estruturas. Para isto, fazemos uso de técnicas biofísicas como dicroísmo circular, caloria diferencial de varredura e espectroscopias ópticas, e biomoleculares como desenvolvimento de oligonucleotídeos, reações de cadeia polimerase e análise de restrição. A outra vertente desta dissertação, tem como foco de estudo a proteína ligante de acil-CoA de Cryptococcus neoformans (CnACBP) clonada pela primeira vez em nosso laboratório. Homólogos de ACBP foram encontrados em todos os organismos distribuídos nos quatro reinos eucariotos, com alta similaridade sequencial (~48%). A sua presença ao longo dos reinos e seu envolvimento em diversos mecanismos metabólicos essenciais relacionados ao éster acil-CoA levaram à conclusão de que se trata de uma housekeeping protein, e não uma proteína específica, confinada a um tipo especializado de célula. Este trabalho traz uma caracterização inicial da CnACBP que busca esclarecer questões ainda em aberto e também aprofundar o conhecimento ainda muito vago de como cargas e a presença do ligante podem influenciar estrutura, estabilidade e função através de técnicas termodinâmicas e espectroscópicas antes de um aprofundamento de seu papel no interior da célula e interações com outras proteínas. / In this study, we used a multi technique approach to understand the basic molecular interactions of two proteins that have quite different biological functions. The first, chlorocatechol 1,2- dioxygenase (Pp 1,2-CCD), has an environmental appeal due to it ability to catalyze the degradation of chlorocatechol, a common intermediate in the end of the decomposition of many polycyclic aromatic hydrocarbons. This characteristic of decontaminating polluted soils and waters suggest a great potential for applications in bioremediation mechanisms. Moreover, the presence of amphipathic molecules at the interface of the CCD monomers raised issues related to the ability of this enzyme family of binding to biological membranes. Such information broadens the knowledge of the basic mechanisms of enzyme action, increasing the possibility of interaction partners and may lead to other forms of control of the biological activity for use in biotechnological applications, such as biosensors development. The study of this enzyme is therefore, aimed at understanding their interactions with mimetic membrane and immobilization attempts of the protein in these structures. For this purpose, we make use of biophysical techniques such as circular dichroism, differential scanning calorimetry and optical spectroscopies and biomolecular techniques, such as development of primers, polymerase chain reaction and restriction analysis. The other aspect of this dissertation is focused on the study of acyl-CoA binding protein of Cryptococcus neoformans (CnACBP) cloned for first time in our laboratory. Homologues of ACBP were found in all organisms distributed in the four kingdoms of eukaryotes, with high sequence similarity (~ 48%). Its widespread presence and their involvement in several key metabolic pathways related to the acyl-CoA ester led to the conclusion that ACBP is a housekeeping protein and not a specific protein contained a specialized cell type. Here we present an initial characterization of CnACBP that seeks to relevant issues regarding the proteins function. Our goal was to increase the still vague knowledge on how electrical charges and the presence of the binding partner may influence the structure, stability and function through thermodynamic and spectroscopic techniques. This is an initial step toward the full understanding of the role of protein in the cell.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-01122016-092008 |
| Date | 30 September 2016 |
| Creators | Micheletto, Mariana Chaves |
| Contributors | Costa Filho, Antônio José da |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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