Cette thèse a été réalisée dans le cadre du projet Futurol, un projet national français qui vise à produire du bioéthanol à partir de biomasses végétales telles que le bois ou la paille de céréale. Pour cela, la biomasse doit être prétraitée puis digérée enzymatiquement pour libérer des sucres fermentescibles. Ma contribution dans ce projet a été de découvrir des enzymes originales pour l’hydrolyse de l’hémicellulose, un hétéropolysaccharide, constituant majeur de la paroi cellulaire des cellules végétales. Afin de rechercher de nouveaux biocatalyseurs, une approche de métagénomique a été adoptée afin de sonder les intestins de deux espèces de termites : N. corniger, un termite xylophage, et T. hispaniolae un termite humivore / xylophage. 30 000 clones métagénomiques ont été criblés sur 10 substrats cellulosiques et hémicellulosique, et 660 hits ont été obtenus. La comparaison phénotypique a montré une différence claire entre ces deux banques, probablement liée au régime alimentaire des deux espèces de termite. Le séquençage de 45 clones N. corniger a révélé 120 séquences codant pour des enzymes originales, de nombreuses étant multimodulaires et / ou organisées en cluster de gènes. Dans un second temps, une approche à haut-débit a été adoptée pour le clonage, l’expression et la caractérisation légère de 104 enzymes entières ou formes tronquées. 45 protéines recombinantes ont été produites de manière soluble, et les activités de 19 enzymes et de 12 modules enzymatiques ont été montrées, permettant la mise au point d’une boite à outil hemicellulolytique. Dans certains cas, l’activité de modules classés « Inconnus » a pu être déterminée. Cette approche a été particulièrement pertinente dans le cas de Pm69, une enzyme multimodulaire GH3-UNK-CBM48-CE1 montrant les 3 activités glucosidase, xylosidase and estérase. Cette étude a permis de poser les bases d’un brevet sur cette enzyme. D’un autre côté, les enzymes ayant montré une activité xylanase ou féruloyle-estérase se sont révélées complémentaires d’un cocktail cellulolytique durant la dégradation de paille de blé prétraitée. Enfin, dans une troisième partie, nous avons étudié un fragment d’ADN provenant la banque P. militaris, codant pour 19 ORFs et appartenant à une espèce du genre Bacteroides. La caractérisation biochimique d’Abn43A, Abn43B, Abf51A et Abf51B-trunc a montré que ces 4 enzymes portent des actions complémentaires sur l’hydrolyse de l’arabinane, et qu’elles peuvent agir de manière synergique pour la dégradation de ce polymère pectique. Enfin, l’étude détaillée des 19 ORFs codées sur ce fragment d’ADN nous a permis de proposer un schéma global de détection, d’hydrolyse et de métabolisation de l’arabinane par cette espèce du genre Bacteroides. / This thesis was performed in the context of the Futurol project, a French national project that aims at producing bioethanol from plant biomass such as wood and cereal straw. To reach that goal, the biomass must be pretreated, and enzymatically degraded to release fermentable simple sugar. My implication in that project was to discover original enzymes that can hydrolyze the hemicellulose, a major heteropolysaccharide found in plant cell wall.To mine for new biocatalysts, the gut microbial communities of two species of termite were investigated by a metagenomic approach : Nasutitermes corniger, a wood-feeder termite, and Termes hispaniolae supposed to be a soil-wood feeder. 30 000 metagenomic clones were screened on an array of 10 cellulosic and hemicellulosic substrates and 660 hits were obtained. Phenotypic comparison showed clear differences between both environments, probably related to the diet of the termite. The sequence of 45 N. corniger metagenomic inserts revealed 120 original sequences encoding for putative enzymes of interest. Original sequences encoding for multimodular enzymes were revealed and many ORFs were organized in clusters, suggesting that these enzymes are encoded on Polysaccharides Utilization Locus. In a second part, a high-throughput approach was used for the cloning, the expression and the slight characterization of 104 full-size and truncated enzymes. Forty five recombinant proteins were produced soluble, and their investigation revealed the activity of 19 enzymes and of 12 enzymatic modules, representing a hemicellulolytic tool-box for endo- and exo-type activities. In some cases, the implication of “Unkown” domains in the activity of multimodular enzymes was demonstrated. This approach was particularly efficient for the study of the GH3-UNKCBM48-CE1 Pm69, and this study triggered the patent process for this multiactive glucosidase, xylosidase and esterase. The xylanases and the feruloyl esterases were shown to be particularly efficient to supplement cellulolytic cocktails on pretreated wheat straw. In a third part, we investigated a DNA fragment belonging to a species of the genus Bacteroides and that encoded 19 ORFs. The biochemical characterization of Abn43A, Abn43B, Abf51A and Abf51B-trunc showed that these four enzymes harbored complementary actions for the hydrolysis of the arabinan, and that they can act synergistically for the hydrolysis of this pectic polymer. We also revealed that Abn43B had an original mode of action that we classified as exo-arabinanase. Finally, the in-depth study of the 19 ORFs allowed us to propose the entire scheme for arabinan detection, hydrolysis and utilization by the Bacteroides species carrying this DNA sequence
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014ISAT0040 |
| Date | 12 September 2014 |
| Creators | Arnal, Gregory |
| Contributors | Toulouse, INSA, O'Donohue, Michael, Dumon, Claire |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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