A resistência natural do gambá Didelphis marsupialis ao veneno de serpentes se deve a fatores antibiotrópicos presentes em seu soro, do qual DM43 é um dos responsáveis pela inibição da atividade hemorrágica. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação desta proteína contra a metaloprotease contida no veneno pretendeu-se, neste trabalho, otimizar as condições de cristalização de DM43, na tentativa de determinar sua estrutura por difração de raios-X. Ensaios de cristalização revelaram que o sulfato de amônio é o precipitante mais eficiente na produção de cristais de DM43. A visualização e indexação dos padrões de difração destes cristais permitiram apenas a determinação dos parâmetros de sua cela unitária, devido a baixa qualidade dos mesmos. Deste modo, os seguintes parâmetros de cela unitária foram encontrados: a = b = 117.34 (0.03) Å, c = 193.39 (0.02)Å, ?=?=90° e ? = 120°, correspondentes ao sistema cristalino trigonal ou hexagonal. A recente determinação da sequência de aminoácidos de DM43, possibilitou modelar sua estrutura tridimensional por homologia utilizando o método de satisfação das restrições espaciais. Os três domínios tipo imunoglobulina de DM43 foram modelados em duas partes a partir da estrutura de referência KIR2DL1(1nkr) homóloga a dois domínios C-terminais de DM43, com apenas 27.72% de identidade. O domínio N-terminal denominado D0, foi modelado separadamente contra o domínio C-terminal de KIR2DL1 com um grau de identidade igual a 28.89%. A partir do programa GRASP e PATCHES, foram detectadas as prováveis regiões de ligação entre as duas partes da molécula e uma possível região responsável pela dimerização no domínio D2 de DM43. Interessantemente, resíduos polares em KIR2DLs que foram substituídos por hidrofóbicos em DM43, concentrando-se em uma face do domínio D2 ausente de sítios de glicosilação, o que coincide com as observações de dimerização do receptor do hormônio de crescimento. Um motivo estrutural característico de receptores hematopoiéticos identificados como WSXWS box, foi encontrado em todos os domínios de DM43, especialmente no domínio D2. Supõe-se que a sua existência esteja relacionada com a orientação relativa dos domínios por manter o primeiro triptofano do motivo posicionado exatamente na interface entre os domínios. Surge ainda uma fita extra (F´), no domínio D2, não pertencente ao enovelamento imunoglobulina devido a presença da Pro273, muito bem conservada, a três resíduos do motivo WSXWS. Esta fita parece desempenhar um papel importante na orientação do motivo pois além de formar ligações de hidrogênio com a fita G do domínio anterior, posiciona corretamente o primeiro triptofano do motivo na interface. Somando-se a isto, a presença de resíduos hidrofóbicos na interface dos domínios D1 e D2pode estar contribuindo para a orientação angular relativa menor que 90° entre os dois domínios. Uma interpretação análoga a de hormônios de crescimento sugere que, os loops entre as fitas AB, CC´ e EF do domínio 1, BC e FG do domínio 2 e o linker entre estes dois domínios, estejam envolvidos na interação da metaloprotease com DM43. / The natural resistance of the opossum, Didelphis marsupialis, towards snake venom is due to antibothropic factors present in the blood serum, of which DM43 is one. It is responsible for the inhibition of the hemorrhagic activity of the venom. With a view to better understanding the mechanism of action of this protein against venom metalloproteases, one of the aims of the present work was to optimize the crystallization conditions of DM43 in order to determine its three-dimensional structure by X-ray diffraction. Crystallization trials revealed that ammonium sulphate was the best precipitant. Visualization and indexing of the diffraction patterns from such crystals only allowed for the determination of the unit cell parameters due to their inherently low quality. The values obtained were a = b = 117.34 (0.03) \'ANGSTRON\', c = 193.39 (0.02) Å, ?=?= 90° e ? = 120°, corresponding to the trigonal or hexagonal crystal systems. The recent determination of the amino acid sequence of DM43 permitted the homology modelling of its three-dimensional structure by satisfaction of spatial restraints. The three immunoglobulin-like domains of DM43 were modelled in two separate parts from the reference structure KIR2DL1 (1nkr), homologous to the two C-terminal domains of DM43, with which its shares 27.72% sequence identity. The N-terminal domain, denominated D0, was separately modelled based on the C-terminal domain of KIR2DL1, with which it shares 28.89% identity. The programs PATCHES and GRASP were used to detect the probable interface region between the two separate parts of the molecule as well as a region probably responsible for dimerisation. Polar residues in KIR2DL1 which had been substituted by hydrophobic residues in DM43 are observed concentrated on one face of the molecule devoid of glycosilation sites (D2) coinciding with the dimerisation interface observed in the growth hormone receptor. A structural motif characteristic of the haematopoetic receptor family, identified as the WSXWS box, was observed to some extent in all three domains of DM43 and most evident in domain D2. It is speculated that the existence of this motif is related to the relative orientation of the domains, by maintaining the first tryptophan of the motif positioned at the domain interface. An additional ?-strand (F) in D2, which is not characteristic of the immunoglobulin fold, is observed due to the presence of the conserved Pro273, three-residues prior to the WSXWS box. This strand appears to play an important role in correctly positioning the motif as it forms hydrogen bonds with strand G of the previous domain thus orientating the first tryptophan of the motif at the interface. The presence of hydrophobic residues at the interdomain interface, may also contribute to stabilizing the acute angular relationship between D1 and D2. An analogous interpretation to that given for the growth hormone receptor, suggests that the loops between ?-strands AB, CC\' and EF of domain D1 and between strands BC and FG do domain D2 plus the linker region, are involved in the binding of metalloproteinase by DM43.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06012009-103446 |
| Date | 26 June 2000 |
| Creators | Makino, Débora Lika |
| Contributors | Garratt, Richard Charles |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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