Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης, επιτελεί καθοριστικό ρόλο στη σωστή λειτουργία της νευρομυϊκής σύναψης. Η δυσλειτουργία του υποδοχέα είναι υπεύθυνη για την εκδήλωση της βαριάς μυασθένειας, η οποία αποτελεί αυτοάνοσο νόσημα. Η αποκάλυψη της τρισδιάστατης δομής του υποδοχέα αποτελεί βασική προϋπόθεση στην κατανόηση της λειτουργίας και του ρόλου του στη δημιουργία της βαριάς μυασθένειας. Καθώς όμως, ο υποδοχέας είναι ένα σχετικά μεγάλο μόριο, με αρκετές υδρόφοβες περιοχές, η λύση της τρισδιάστατης δομής του καθίσταται δύσκολη. Τα μόνα δεδομένα που διαθέτουμε προέρχονται από μελέτες του AChR του ελασματοβράγχιου Torpedo californica, ο οποίος παρουσιάζει ικανοποιητική συγγένεια με τον υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, και από μελέτες κρυσταλλογραφίας μια πρωτεΐνης του σαλιγκαριού Lymnaea stragnalis, ικανής να δεσμεύει ακετυλοχολίνη (AChBP), η οποία όμως παρουσιάζει μικρή ομοιότητα με τον ανθρώπινο μυϊκό υποδοχέα.
Για την αντιμετώπιση των παραπάνω δυσκολιών, εκφράστηκαν τα εξωκυτταρικά τμήματα (extracellular domain: ECD) των β και δ υπομονάδων του ανθρώπινου νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης της Pichia pastoris. Οι δύο υπομονάδες κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλους φορείς έκφρασης, pPIC9 και pPICZaA. Τα ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια που απομονώθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν για λειτουργικές μελέτες στα πλαίσια θεραπευτικών προσεγγίσεων και την ολοκλήρωση των μελετών σχετικά με την εξωκυτταρική περιοχή του AChR.
Από τα πειραματικά δεδομένα που προέκυψαν, διαπιστώθηκε ότι η εξωκυτταρική περιοχή της β υπομονάδας, εκφράζεται σε διμερή μορφή και σε μεγαλύτερες ποσότητες συγκρινόμενη με τα ECDs των υπολοίπων υπομονάδων που εκφράστηκαν στο ίδιο σύστημα. Το πολυπεπτίδιο αυτό, διαθέτει παράλληλα και την ικανότητα να απομονώνει αντισώματα από ορούς μυασθενικών, από ορισμένους εκ των οποίων τα ποσοστά έφταναν και το 98%. Η διαδικασία απομόνωσης αντισωμάτων βασίζεται στην ακινητοποίηση των ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων σε στήλη σεφαρόζης και χρήση της για αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων έναντι της αντίστοιχης υπομονάδας.
Στην περίπτωση της δ υπομονάδας τα αποτελέσματα που προέκυψαν από αντίστοιχες μελέτες δεν ήταν τα αναμενόμενα. Συγκεκριμένα, αν και η πρωτεΐνη απομονώνεται σε διαλυτή μορφή, δημιουργεί συσσωματώματα, τα οποία δεν επιτρέπουν τη χρήση της για δομικές μελέτες. Παράλληλα, οι ποσότητες που προκύπτουν είναι μικρές και δεν διευκολύνουν οποιαδήποτε χρήση της πρωτεΐνης.
Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, αντικαταστάθηκε η θηλιά του εξωκυτταρικού τμήματος της πρωτεΐνης με αυτή της AChBP, η οποία όπως έχει δειχθεί και στο παρελθόν σε άλλες υπομονάδες, βελτίωνε την ποιότητα και την ποσότητα της εκφραζόμενης πρωτεΐνης. Με αυτόν τον τρόπο η διαλυτότητα, καθώς και η ποσότητα, της απομονωμένης πρωτεΐνης αυξήθηκαν. Τα πειράματα ανοσοπροσροφήσεων όμως στην περίπτωση της δ υπομονάδας, δεν επέφεραν κάποιο σημαντικό αποτέλεσμα συγκρινόμενο με τα αντίστοιχα αποτελέσματα ανοσοπροσροφήσεων με τα ECDs των υπολοίπων υπομονάδων του μυϊκού AChR, τουλάχιστον για τους ορούς που ελέγχθηκαν. Εντοπίστηκε όμως ένας ορός, ο οποίος δεν αποκλύει την πιθανότητα εύρεσης κι άλλων θετικών αντι-δ ορών.
Από όλα τα παραπάνω δεδομένα, προκύπτει ότι η εξωκυτταρική περιοχή της β υπομονάδας μπορεί να χρησιμοποιηθεί στα πλαίσια θεραπευτικών προσεγγίσεων και πιθανότατα και σε δομικές μελέτες, σε αντίθεση με τη δ, η οποία στη συγκεκριμένη μορφή δεν παρουσιάζεται κατάλληλη για δομικές μελέτες, καθώς οι παραγόμενες ποσότητες αποτρέπουν κάθε δυνατή προσπάθεια, δίχως όμως να μπορεί να αποκλειστεί η συμβολή της και σε μελλοντικά θεραπευτικά συστήματα. / -
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/565 |
| Date | 23 October 2007 |
| Creators | Γαβρά, Ήρα |
| Contributors | Τζάρτος, Σωκράτης, Gavra, Ira, Πουλάς, Κώστας, Παπαπετρόπουλος, Ανδρέας, Τζάρτος, Σωκράτης |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0027 seconds