Ce travail se proposait de développer, à l’échelle du laboratoire, un procédé de production microbienne d’acide hyaluronique (AH), biopolymère d’intérêt pour la cosmétique et la santé, chez une bactérie lactique naturellement productrice, Streptococcus zooepidemicus. Une étude bibliographique a permis d’identifier les points potentiellement critiques pour ce travail qui sont la composition du milieu de culture (identification de nutriments essentiels à la synthèse d’acide hyaluronique), les conditions opératoires et plus particulièrement d’oxygénation (transfert d’oxygène mais aussi maintien du potentiel d’oxydo-réduction), en relation avec les performances de production et le métabolisme des souches considérées. Une étape préliminaire a consisté en un développement et une amélioration de techniques analytiques pour disposer d’outils pertinents de suivi du métabolisme de Streptococcus zooepidemicus. La quantification de la biomasse hors acide hyaluronique ainsi que la détection de l’activité hyaluronidasique ont ainsi été développées tandis que d’autres méthodes chromatographiques et enzymatiques ont été simplement appliquées et validées aux substrats et métabolites considérés. La mise en œuvre de souches « environnementales » prélevées sur des sites infectieux chez le cheval, ainsi que de souches de collection, a permis dans un premier temps de formuler un milieu de culture et de définir des conditions de mise en œuvre exploitables à plus grande échelle pour la production d’AH. Des résultats très encourageants ont pu être obtenus avec des productions d’AH supérieures aux essais de la littérature, tout en mettant en avant des facteurs influents cruciaux tels que la concentration initiale en glucose ou encore l’oxygénation des cultures. L’influence de ces facteurs a été étudiée par la suite par le biais de cultures en bioréacteur de laboratoire en modes discontinu et discontinu-alimenté avec pour résultat l’obtention d’un mode de mise en œuvre et de conditions physico-chimiques de production améliorées. En parallèle, une étape importante de ce travail a consisté en une approche d’amélioration de souches « environnementales » par mutagénèse aléatoire, les performances de ces souches s’avérant initialement décevantes. Des mutants surproducteurs ont ainsi été générés, caractérisés au niveau de leurs performances métaboliques et conservés. En dernier lieu, un des mutants les plus performant a été mis en œuvre dans les conditions et le mode de culture sélectionnés précédemment. Tant le niveau de production d’AH, la productivité associée, que les tailles obtenues ont permis de valider ce travail de développement d’un procédé microbien de production d’AH, tout en identifiant de nouvelles voies d’amélioration / This work intended to develop a laboratory scaleproduction process ofhyaluronic acid (HA), a biopolymer of health and cosmetic interest, using a naturally AH producing lactic acid bacterium, Streptococcus zooepidemicus. A literature review allowed to identify the following critical points: firstly, the composition of the culture medium (identification of essential nutrients for microbial growth and synthesis of HA), secondly, the oxygenation level (oxygen transfer and associated redox modifications), and finally, in relation with, the production and metabolism abilities of the considered strains. A preliminary step was dedicated to the developmentorthe improvementof analytical techniques in order todispose of appropriate tools for the monitoring of Streptococcus zooepidemicus metabolism. The quantification of the biomass without considering capsular HA fraction as well as detection of hyaluronidase activity have been developed while other chromatographic and enzymatic methods have been more basically applied to and validated with the substrates and metabolites considered. The laboratory scale cultures of collection (ATCC) as well as “environmental” strains were initially used to formulate a workable cultivation broth and to define suitable culture conditionsfor a use at a larger scale to produce HA. Very positive results were obtained with higher production of HA in comparison with literature assays, while critical influencing factors such as the initial glucose concentration or the oxygenation levelin cultures were highlighted. The influence of these factors was thoroughly studied with bioreactor cultures in both batch and fed-batch modes leading to improved cultivation conditions and culture mode. In parallel, another important step consisted in the highly performance improvement of initially low HA producing "environmental" strains via random mutagenesis. Very promising overproducing mutants have therefore been generated, characterized in their kinetic and metabolic capabilities and long-term stored. At last, one of the best and most reliable mutant has been cultivated with the best previously selected medium composition and operating conditions. Both the HA production level, productivity and size observed validated the findings of this process development work, while helping to identify new improvement domains and strategies
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2014LORR0228 |
| Date | 05 December 2014 |
| Creators | Leblanc, Pierrick |
| Contributors | Université de Lorraine, Marc, Ivan, Rondags, Emmanuel |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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