[pt] Nos últimos anos, as vantagens do uso de agentes de contraste de ultrassom
(UCA) com distribuição de tamanho monodisperso foram destacadas. Caracterizadas
por um coeficiente de variação (CV) inferior a 5 por cento, as microbolhas monodispersas
têm o potencial de melhorar a qualidade das imagens de ultrassom (melhorando a
relação sinal/ruído e reduzindo os efeitos de sombra). Também facilita o
monitoramento da freqüência de ressonância das microbolhas, abrindo possibilidades
nas áreas de imagem molecular e medições de pressão não-invasiva. Além disso, as
bolhas monodispersas podem otimizar a entrega de drogas, genes e gases terapêuticos
(por exemplo, sonotrombólise, sonoporação, abertura da barreira hemato-encefálica).
No entanto, até agora, ao contrário das bolhas polidispersas, a liofilização de
populações monodispersas de microbolhas, sem deteriorar sua monodispersividade,
continuam sendo um desafio. Assim, hoje, as bolhas monodispersas não podem ser
armazenadas nem transportadas. Isto representa um gargalo para seu uso em
aplicações clínicas. Tentativas feitas para resolver o problema têm usado solventes
tóxicos, levantando questões regulatórias
O objetivo do presente trabalho foi de desenvolver uma nova técnica de
liofilização para microbolhas monodispersas que não degradassem sua distribuição
de tamanho, ou suas propriedades acústicas, sem o uso de solventes tóxicos. Como
primeira etapa do projeto, foram fabricados dispositivos microfluídicos com
focalização de escoamento (flow-focusing) para produzir microbolhas com
distribuição de tamanho altamente monodispersa (CV menor que 5 por cento). Durante esta etapa, foi
realizada a otimização da formulação das microbolhas e dos materiais crioprotetores.
Foi realizada a caracterização geométrica de duas populações de microbolhas com
diâmetros médios de 40 micrômetros e 5 micrômetros . Com o uso de uma câmera de alta velocidade
acoplada a um microscópio ótico, imagens de todas as etapas do processo de
liofilização das microbolhas foram capturadas e analisadas, visando controlar a
distribuição de tamanho e a taxa de produção das microbolhas. As etapas do processo
de liofilização consistiram na produção, coleta, congelamento, liofilização e
ressuspensão. O desenvolvimento de uma nova técnica de recuperação, onde as
microbolhas eram armazenadas em monocamadas, resultou em uma redução drástica
da interação entre as bolhas durante a liofilização. Desta forma, foi possível preservar
a monodispersão durante o processo de liofilização, resultando em um CV menor que 6 por cento para
a população de microbolhas ressuspensas. Os ensaios de microscópio eletrônico de
varredura ambiental (ESEM) demonstraram uniformidade nas cascas das
microbolhas liofilizadas com uma espessura de parede estimada em 70nm.
Na segunda etapa do projeto, foi realizada uma caracterização da resposta
acústica de retrodifusão das microbolhas liofilizadas em forma de PVA, em
comparação com as microbolhas recém produzidas e as microbolhas polidispersa
SonovueTM disponíveis comercialmente. Primeiramente, a resposta acústica de
retrodifusão das microbolhas foi avaliada em duas configurações diferentes: a célula
centimétrica (recipiente grande - 45mmx10mmx30mm), e o milli-canal (sistema
confinado no qual o líquido está em repouso - 10 mmx35 mmx1 mm). Usando um
transdutor acústico focalizado com frequência de 2,25MHz, as respostas acústicas
das microbolhas, na forma de frequência e amplitude de ressonância fundamental,
antes e depois do processo de liofilização, foram comparadas para a população de
bolhas de 5 micrômetros de diâmetro. Verificou-se que a variação de amplitude e frequência
de ressonância fundamental das bolhas estava dentro da faixa de incerteza
experimental, sugerindo que suas propriedades acústicas foram preservadas.
Observamos também, de acordo com a literatura, que existe uma dependência linear
entre a concentração da população de microbolhas (sem liofilização) e a amplitude
do coeficiente de retrodifusão. Posteriormente, foi feita uma comparação da resposta
de retrodispersão acústica para bolhas monodispersas e polidispersas. Também, de
acordo com a literatura, observamos uma amplitude no sinal de resposta das bolhas
monodispersas de 8 a 10 vezes maior que a das bolhas polidispersas, para a mesma
concentração in vitro. Também foi possível observar a menor incerteza no
monitoramento do pico de ressonância fundamental das bolhas e uma menor largura
de banda para a população de bolhas monodispersas. Finalmente, utilizando a
abordagem de imagens de matriz universal de ultrassom, desenvolvida no Institut
Langevin, a resposta acústica de retrodifusão da população monodispersa liofilizada
e polidispersa foi avaliada em um tecido artificial com impedância acústica similar
ao tecido humano. Os resultados preliminares reforçam os resultados das medições
acústicas de retrodifusão na célula centimétrica e no milicanal, nos quais a população
monodispersa apresentou uma largura de banda significativamente reduzida em
comparação com a ampla largura de banda da população polidispersa.
O presente trabalho apresentou com sucesso uma nova técnica desenvolvida
para liofilizar as microbolhas monodispersas sem degradar suas propriedades
geométricas e acústicas. Assim, propusemos uma nova geração de agentes de
contraste ultrassom na forma de um pó liofilizado estável que pode ser transportado
e armazenado por meses e ressuspenso para uso em aplicações clínicas. / [en] In recent years, the advantages of using ultrasound contrast agents (UCA) with
monodisperse size distribution have been highlighted. Characterized by a coefficient
of variation (CV) lower than 5 percent, monodisperse microbubbles have the potential to
improve the quality of ultrasound images (improving signal-to-noise ratio and
reducing shadowing effects. It also facilitates microbubble resonance frequency
monitoring, opening possibilities in the areas of molecular imaging and non-invasive
pressure measurements. In addition, monodisperse bubbles can optimize the drugs,
genes, and therapeutic gas delivery (e.g. sonotrombolysis, sonoporation, blood-brain
barrier opening).
However, thus far, contrarily to polydisperse bubbles, freeze-drying
monodisperse populations of fresh microbubbles, without deteriorating their
monodispersity, remains a challenge. Thereby, today, monodisperse bubbles can
neither be stored nor transported. This represents a bottleneck for their use in clinical
applications. Attempts made to solve the problem have used toxic solvents, raising
regulatory issues
The objective of the present work was to develop a new freeze-drying
technique for monodisperse microbubbles that did not degrade their size distribution,
or their acoustic properties, without the use of toxic solvents. As the first step of the
project, flow-focusing microfluidic devices were fabricated to produce microbubbles
with highly monodisperse size distribution (CV less than 5 percent). During this step, the
optimization of the microbubble formulation and cryoprotectant materials was
performed. Geometric characterization of two of microbubbles with mean diameters
of 40 Micrometers and 5 Micrometers was performed. With the use of a high-speed camera coupled to
an optical microscope, images of all stages of the freeze-drying process of the
microbubbles were captured and analyzed, aiming to control the size distribution and
production rate of the microbubbles. The steps of the freeze-drying process consisted
of production, collection, freezing, lyophilization, and resuspension. The
development of a new retrieval technique, where the microbubbles were stored in
monolayers, resulted in a drastic reduction of the interaction between the bubbles
during lyophilization. In this way, it was possible to preserve the monodispersity
during the freeze-drying process, resulting in a CV less than 6 percent for the resuspended
microbubble population. Environmental scanning electron microscope (ESEM)
assays demonstrated uniformity in the shells of the freeze-dried microbubbles with
an estimated wall thickness of 70nm.
In the second stage of the project, a characterization of the backscatter acoustic
response of the freeze-dried monodisperse PVA-shelled microbubbles, in
comparison with freshly produced microbubbles, and commercially available
polydisperse microbubbles SonovueTM was conducted. Firstly, the backscatter
acoustic response of the microbubbles was evaluated in two different setups: the
centimetric cell (large container - 45mmx10mmx30mm), and the milli-channel
(confined system in which the liquid is at rest - 10 mmx35 mmx1 mm). Using a
focused acoustic transducer with a frequency of 2.25MHz, the acoustic responses of
the microbubbles, in the form of the fundamental resonance frequency and amplitude,
before and after the freeze-drying process was compared for the bubble population
of 5 Micrometers diameter. It was found that the variation of amplitude and fundamental
resonance frequency of the bubbles were within the experimental uncertainty range,
suggesting that their acoustic properties were preserved. We also observed, in
agreement with the literature, that there is a linear dependence between the
concentration of the microbubble population (without freeze-drying) and the
amplitude of the backscatter coefficient. Subsequently, a comparison of the acoustic
backscatter response was performed for monodisperse and polydisperse bubbles.
Also, in agreement with the literature, we observed an amplitude in the response
signal of the monodispersed bubbles of 8 to 10 times higher than that for the
polydispersed ones, for the same in vitro concentration. It was also possible to
observe the lower uncertainty in monitoring the fundamental resonance peak of the
bubbles and a smaller bandwidth for the monodispersed bubble population. Finally,
using the universal ultrasound matrix imaging approach, developed at Institut
Langevin, the backscatter acoustic response of the freeze-dried monodisperse and
polydisperse population was evaluated in a phantom mimicking tissue. The
preliminary results reinforce the findings from the backscatter acoustic measurements
in the centimetric cell and the milli-channel, in which the monodisperse population
presented a significantly reduced bandwidth in comparison with the wide bandwidth
of the polydisperse population.
The present work successfully presented a new technique developed to freezedry monodisperse microbubbles without degrading their geometrical and acoustic
properties. Thus, we proposed a new generation of ultrasound contrast agents in the
form of a stable freeze-dried powder that can be transported and stored for months
and resuspended for use in clinical applications. / [fr] Ces dernieres années, les avantages de l utilisation d agents de contraste
ultrasonores (ACU) à distribution de taille monodisperse ont été mis en évidence.
Caractérisées par un coefficient de variation (CV) de leur diamètre inférieur à 5 Pour cent,
les microbulles monodisperses ont le potentiel d améliorer la qualité des images
ultrasonores (amélioration du rapport signal/bruit et réduction des effets d ombre).
Elles facilitent également le contrôle de la fréquence de résonance des microbulles,
ouvrant des possibilités dans les domaines de l imagerie moléculaire et des mesures
de pression non invasives. En outre, les bulles monodisperses peuvent optimiser
l administration de médicaments, de gènes et de gaz thérapeutiques (par exemple,
sonotrombolyse, sonoporation, ouverture de la barrière hémato-encéphalique).
Cependant, jusqu à présent, contrairement aux bulles polydisperses, la
lyophilisation de populations monodisperses de microbulles fraiches, sans
détérioration de leur monodispersité, reste un défi. Ainsi, aujourd hui, les bulles
monodisperses ne peuvent être ni stockées ni transportées. Cela représente un
goulot d étranglement pour leur utilisation dans des applications cliniques. Les
tentatives faites pour résoudre ce problème ont utilisé des solvants toxiques, ce qui
soulève des problèmes de réglementation.
L objectif du présent travail était de développer une nouvelle technique de
lyophilisation des microbulles monodisperses qui ne dégrade pas leur distribution de
taille, ni leurs propriétés acoustiques, et ce sans utiliser de solvants toxiques. La
première étape du projet a consisté à fabriquer des dispositifs microfluidiques de
focalisation du flux pour produire des microbulles avec une distribution de taille
hautement monodisperse (CV moins que 5 Pour cent). Au cours de cette étape, l optimisation de la
formulation des microbulles et des matériaux cryoprotecteurs a été réalisée. La
caractérisation géométrique de deux microbulles avec des diamètres moyens de
40 micrometres et 5 micrometres a été menée. A l aide d une caméra à haute vitesse couplée à un
microscope optique, des images de toutes les étapes du processus de lyophilisation
des microbulles ont été capturées et analysées, dans le but de contrôler la
distribution de taille et le taux de production des microbulles. Les étapes du
processus de lyophilisation comprenaient la production, la collecte, la congélation,
la lyophilisation et la remise en suspension. Le développement d une nouvelle
technique de récupération, ou les microbulles étaient stockées en monocouches, a
permis de réduire considérablement l interaction entre les bulles pendant la
lyophilisation. De cette maniere, il a été possible de préserver la monodispersité
pendant le processus de lyophilisation, ce qui a permis d obtenir un CV moins que 6 Pour cent pour la
population de microbulles remise en suspension. Les analyses au microscope
électronique à balayage environnemental (ESEM) ont démontré l uniformité des
enveloppes des microbulles lyophilisées avec une épaisseur de paroi estimée à
70nm.
Dans la deuxième étape du projet, une caractérisation de la réponse
acoustique (en rétrodiffusion) des microbulles monodisperses lyophilisées et
enveloppées de PVA a été réalisée et comparée avec celles de microbulles
fraichement produites et de microbulles polydisperses disponibles dans le
commerce (SonovueTM). Tout d abord, la réponse acoustique en rétrodiffusion des
microbulles a été évaluée dans deux configurations différentes : la cellule
centimétrique (grand récipient - 45mmx10mmx30mm), et le milli-channel (systeme
confiné dans lequel le liquide est au repos - 10 mmx35 mmx1 mm). En utilisant un
transducteur acoustique focalisé avec une fréquence de 2.25MHz, les réponses
acoustiques des microbulles (fréquence de résonance fondamentale et amplitude)
avant et après le processus de lyophilisation ont été comparées pour la population
de bulles de 5 micrometres de diamètre. Il a été constaté que la variation de l amplitude et de
la fréquence de résonance fondamentale des bulles se situait dans la plage
d incertitude expérimentale, ce qui suggère que leurs propriétés acoustiques ont été
préservées. Nous avons également observé, en accord avec la littérature, qu il
existe une dépendance linéaire entre la concentration de la population de
microbulles (sans lyophilisation) et l amplitude du coefficient de rétrodiffusion. Par la
suite, une comparaison de la réponse acoustique a été effectuée pour des bulles
monodisperses et polydisperses. Aussi, en accord avec la littérature, nous avons
observé une amplitude du signal de réponse des bulles monodisperses de 8 à 10
fois supérieure à celle des bulles polydisperses, pour une même concentration in
vitro. Il a également été possible d observer une plus faible incertitude dans le suivi
du pic de résonance des bulles et une plus petite largeur de bande pour la population
de bulles monodisperses. Enfin, en utilisant une approche originale dite d imagerie
matricielle par ultrasons, développée à l Institut Langevin, la réponse acoustique
de la population lyophilisée monodispersée et polydispersée a été évaluée dans un
fantôme simulant les tissus. Les résultats préliminaires renforcent les conclusions
des mesures acoustiques menées dans la cellule centimétrique et le canal
millimétrique, dans lesquelles la population monodisperse présente une largeur de
bande significativement réduite par rapport à la grande largeur de bande de la
population polydisperse.
Le présent travail a permis le développement d une nouvelle technique pour
lyophiliser des microbulles monodispersées sans dégrader leurs propriétés
géométriques et acoustiques. Ainsi, nous avons proposé une nouvelle génération
d agents de contraste ultrasonores se présentant sous la forme d une poudre
lyophilisée stable qui peut être transportée et stockée pendant des mois et remise
en suspension pour être utilisée dans des applications cliniques.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:puc-rio.br/oai:MAXWELL.puc-rio.br:62094 |
| Date | 28 March 2023 |
| Creators | PEDRO NIECKELE AZEVEDO |
| Contributors | MARCIO DA SILVEIRA CARVALHO |
| Publisher | MAXWELL |
| Source Sets | PUC Rio |
| Language | English |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | TEXTO |
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