As Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas (NMPC) Trombocitemia Essencial (TE), Mielofibrose (MF) - são desordens hematopoéticas resultantes da expansão clonal da célula tronco hematopoética alterada. Essas doenças caracterizam-se pela independência dos progenitores hematopoéticos aos estímulos dos fatores de crescimento e citocinas e pela proliferação exacerbada das células da linhagem mielóide com maturação preservada. Os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na patogênese e progressão da TE e MF não foram ainda esclarecidos, mas o mieloacúmulo presente nessas doenças parece estar associado à alteração de proliferação e apoptose celular. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram avaliar em células CD34+ da medula óssea e leucócitos dos pacientes com TE e MF: (1) a expressão de apoptomirs e de genes pró- e anti-apoptóticos pertencentes à via intrínseca e extrínseca da apoptose pela metodologia de RT-PCR em tempo real; (2) expressão de proteínas pró- e anti-apoptóticas por Western-blot; (3) o perfil de sensibilidade das células mononucleares à apoptose induzida por diferentes agentes apoptogênicos pela técnica de citometria de fluxo e (4) correlacionar os resultados obtidos com dados clínico-laboratoriais dos pacientes e com a expressão do gene PRV-1. Em TE, nas células CD34+, foi detectado aumento da expressão de a1, mcl-1, bid, bok e noxa e diminuição de bax em relação aos controles. Nos leucócitos, foi detectada a elevação da expressão de a1, bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok e diminuição de bid e bimEL. Em comparação com o grupo controle, os pacientes com MF apresentaram maior expressão dos genes a1, bcl-w bak, bok e noxa e menor de bcl-2 nas células CD34+. Nos leucócitos dos pacientes com MF foi verificado aumento da expressão dos genes bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok. O c-iap-1 apresentou maior expressão nas células CD34+ dos pacientes com MF e TE, enquanto que o c-iap-2 estava elevado nos leucócitos e células CD34+. Foi ainda detectada a expressão diferencial em TE e MF dos genes pertencentes a via de receptor de morte, como a maior expressão dos genes fas, fas-L, faim e dr4 nas células CD34+ dos pacientes e menor expressão do fas-L e trail nos leucócitos dos pacientes com TE e MF. Os resultados indicaram associação da expressão do gene PRV-1 com a mutação JAK2V617F e com a expressão dos genes a1, bcl-w, bik, bax, c-iap-2 e trail. Com relação à expressão proteica, BCL-XL estava aumentada e TRAIL diminuída em leucócitos de pacientes com MF enquanto que a molécula BID estava diminuída em leucócitos de pacientes com TE. Os miRNA26a, let 7d e miR15a estavam mais expressos nos leucócitos de pacientes com TE e MF. Em pacientes com TE o miR130b estava elevado e o mIR16 diminuído, enquanto que nos pacientes com MF o miR198 estava aumentado. Os linfócitos dos pacientes com TE e MF apresentaram maior resistência à apoptose estimulada por: actinomicina, etoposídeo, teniposídeo, citarabina e estaurosporina do que os linfócitos dos controles. Em conclusão, os dados obtidos sugerem a ligação da alteração do processo de apoptose celular, com a expressão do gene PRV-1 e status da mutação JAK2V617F. Esses resultados contribuem para o melhor entendimento da fisiopatologia das NMPC visto que associam a fisiopatologia da TE e MF com a resistência das células alteradas à apoptose. Essas informações serão úteis no futuro, possibilitando o desenho de novos alvos terapêuticos e a descrição de novos marcadores de prognóstico. / Chronic Myeloproliferative Neoplasms (cMPN) - Essential Thrombocythemia (ET), Primary Myelofibrosis (PMF) and Polycythemia Vera (PV) - are clonal hematopoietic stem cell malignancies characterized by an accumulation of mature myeloid cells in bone marrow and peripheral blood. It seems that apoptotic machinery deregulation contribute to ET and PMF pathogenesis. Despite the advances in the molecular knowledge, the physiopathology of these diseases remains unknown. This study investigated cellular and molecular mechanisms involved in apoptosis process regulation in bone marrow haematopoietic progenitor CD34+ cells and leukocytes from ET and PMF patients. The specifics aims were: (1) to evaluate death receptors family members and Bcl-2 related genes expression as well apoptosis-related microRNAs by Real Time PCR; (2) apoptosis-related protein expression by Western Blot; (3) access mononuclear cells apoptosis resistance by flow cytometry and (4) to correlate the results with JAK2V617F mutation, PRV-1 gene expression and as well clinical data. In ET CD34+ cells, we found overexpression of a1, mcl-1, bid, bok e noxa and a decrease of bax compared to controls, while in leukocytes a1, bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok expression was increased and bid and bimEL expression was lower than in controls. In PMF, a1, bcl-w bak, bok e noxa were overexpressed and bcl-2 downregulated in CD34+ cells. In PMF leukocytes bcl-2, bcl-w e bcl-xL, bad e bok mRNA levels were increased. c-iap-1 was increased in ET and PMF CD34+ cells and c-iap-2 expression elevated in ET and PMF CD34+ cells and leukocytes. Death receptor related genes showed overexpression of fas, fas-L, faim and dr4 in patients CD34+ cells and downregulation of fas-L and trail in ET and PMF leukocytes. We found differential expression of several genes between patients JAK2V617F positive and negative, as well we found correlation between gene expression and JAK2V617F allele burden, white blood cells and platelets count and splenomegaly. PRV-1 gene was overexpressed in ET and PMF leukocytes and showed correlation with JAK2V617F mutation and a1, bcl-w, bik, bax, c-iap-2 and trail gene expression. Regarding protein expression, BCL-XL was increased and TRAIL decreased in PMF leukocytes and BID was decreased in ET leukocytes. miRNA26a, let 7d e miR15a was overexpressed in ET and PMF leukocytes, while miR130b was increased only in ET and miR198 only in PMF. miR16 was downregulated in ET leukocytes comparing to controls. We also detected a resistance to apoptosis-inducers in ET and PMF lymphocytes and we observed correlation between apoptosis percentage and the expression of many studied genes. In conclusion, the results indicate the participations of Bcl-2 family genes and Death Receptor pathway genes, as well PRV-1 and JAK2V617F mutation in these disorders, which contribute to elucidate cMPN physiopathology and might lead to the discovery of new cMPN therapies and molecular markers.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-01112011-165228 |
| Date | 11 October 2011 |
| Creators | Tognon-Ribeiro, Raquel |
| Contributors | Castro, Fabíola Attié de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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