Como em diversos tumores sólidos, no câncer de cabeça e pescoço (HNSCC) a presença de metástases é um importante fator de mal prognóstico. Até o momento, estudos indicam que, no microambiente inflamatório tumoral, a estimulação com o Fator de Necrose Tumoral Alpha (TNF-?) leva à ativação de diferentes vias moleculares, como a via do Fator Nuclear Kappa-B (NF-kB) e PI3K/AKT, que inibem GSK3? e consequentemente, promovem a estabilização e translocação nuclear de SNAIL e betacatenina. De um modo geral, em diversos tipos de câncer, enquanto beta-catenina tem ação em promover a proliferação celular, membros da família SNAIL são capazes de induzir o processo de transição epitélio-mesenquimal (EMT). Sabe-se que os eventos de EMT estão envolvidos tanto na iniciação de metástases quanto na geração de célulastronco tumorais (CSCs), que por sua vez estão associadas à falha terapêutica e recidiva, devido à características que lhe conferem resistência aos tratamentos convencionais. Ao silenciar a expressão gênica de modo pós-transcricional, microRNAs (miRs) tem sido associados à regulação tanto da EMT quanto da geração de CSCs. Com uso da abordagem de High-Content Screening (HCS, análise celular multiparamétrica quantitativa por microscopia automatizada), buscamos investigar a capacidade de um grupo de 30 miRs humanos, muitos deles envolvidos em vias inflamatórias e na pluripotência, em modular aspectos relacionados a sobrevivência celular e EMT, em uma linhagem celular derivada de HNSCC (FADU) sob estímulo inflamatório. Inicialmente, avaliamos o potencial do TNF-? em modular parâmetros morfométricos, bem como a presença/localização de proteínas relacionadas com a EMT e capacidade migratória. Posteriormente, avaliamos o efeito de moléculas miméticas dos miRs em suprimir ou potencializar a sobrevivência celular e EMT em células estimuladas com TNF-?, seguido da identificação de transcritos alvos preditos (bem como das vias de sinalização enriquecidas para estes alvos) comumente alvejados por grupos de miRs que levaram a alterações multiparamétricas similares. De modo geral, miRs que alvejaram RELA e AKT2/AKT3 foram responsáveis pela redução na proliferação celular e EMT, enquanto o oposto foi observado em miRs que alvejaram GSK3B e ARHGAP5 (inibidor de RhoA). O silenciamento por siRNAs específicos contra RELA e CTNNB1, causou à redução na sobrevivência celular, enquanto que o silenciamento de AKT1 e CTNNB1 levou à redução na expressão proteica de SNAIL/SLUG. Finalmente, o silenciamento de RELA, AKT1, GSK3B e CTNNB1 levou a redução na sobrevivência celular e indução a apoptose mesmo na ausência de estimulação com TNF-?. Como um todo, nós demonstramos que a abordagem de HCS permitiu a identificação de miRs com efeitos fenotípicos similares (no contexto de proliferação e EMT) e que, a predição de alvos compartilhados por estes miRs, levou à identificação de alvos e vias de sinalização relevantes do ponto de vista terapêutico. / Like many solid cancers, in head and neck cancer (HNC) the presence of metastases is an important factor of poor prognosis. To date, studies indicate that, in the tumor inflammatory microenvironment, stimulation with Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-?) leads to the activation of different molecular pathways, such as the Nuclear Factor-Kappa B (NF-kB) and PI3K/AKT pathway, inhibiting GSK3? and the degradation of SNAIL and beta-catenin, stabilizing them promoting their nuclear translocation. In general, in several types of cancer, while beta-catenin acts to promote cell proliferation, members of the SNAIL family induce the epithelial-mesenchymal (EMT) transition process. It is known that EMT events are involved both in the initiation of metastases and generation of cancer stem cells (CSCs), which in turn are associated with therapeutic failure and relapse, due to its properties that confer resistance to conventional treatments. By silencing gene expression in a post-transcriptional fashion, microRNAs (miRs) have been associated with the regulation of both EMT and CSCs generation. Using the HighContent Screening (HCS) approach, we sought to investigate the ability of a group of 30 human miRs, many of them involved in inflammatory pathways and pluripotency, to modulate aspects related to cell survival and EMT, in a HNSCC-derived cell line (FADU) under inflammatory stimuli. Initially, we evaluated the potential of TNF-? in modulating morphometric parameters, as well as the presence/location of EMT-related proteins and migratory capacity. Subsequently, we evaluated the effect of miRs mimetic molecules on suppressing or potentiating cell survival and EMT in TNF-?-stimulated cells, followed by the identification of predicted target transcripts (as well as signaling pathways enriched for these targets) commonly targeted by groups of miRs that led to similar multiparametric changes. Overall, miRs that targeted RELA and AKT2/AKT3 were responsible for the reduction in cell proliferation and EMT, while the opposite was observed in miRs that targeted GSK3B and ARHGAP5 (RhoA inhibitor). Gene silencing by specific siRNAs against RELA and CTNNB1 caused a reduction in cell survival, while silencing of AKT1 and CTNNB1 led to reduced protein expression of SNAIL/SLUG. Finally, the silencing of RELA, AKT1, GSK3B and CTNNB1 led to a reduction in cell survival and induction of apoptosis even in the absence of TNF-? stimulation. As a whole, we demonstrated that the HCS approach allowed the identification of miRs with similar phenotypic effects (in the context of proliferation and EMT) and that the prediction of targets shared by these miRs led to the identification of relevant targets and signaling pathways from the therapeutic point of view.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02042018-115113 |
| Date | 10 July 2017 |
| Creators | Sangiorgi, Bruno Braga |
| Contributors | Panepucci, Rodrigo Alexandre |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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