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Previous issue date: 2006-12-31 / Recentemente observou-se que a mitocôndria produz óxido nítrico (NO), que além de radical livre, participa de vários processos fisiológicos. O NO, por si só, é relativamente não-reativo, e na mitocôndria possui uma ação inibitória sobre a citocromo c oxidase (COX). Entretanto, o NO pode ser convertido em um grande número de derivados mais reativos, que podem levar a lesões oxidativas em vários componentes mitocondriais, como o DNA mitocondrial (DNAmt), proteínas e membranas mitocondriais. A síntese do NO na mitocôndria sugere que o NO tenha um papel regulador importante na função mitocondrial. O objetivo deste estudo foi avaliar a síntese de NO em linhagens celulares com diferentes defeitos na cadeia respiratória e verificar se existe nitração de proteínas, o que indicaria a presença de lesão oxidativa por radicais de nitrogênio. A síntese de NO foi verificada através da quantificação de nitritos e do uso de um marcador fluorescente para NO, o DAF-FM diacetato. Foram avaliadas linhagens celulares derivadas de osteosarcoma cíbridas para as mutações 3243 A>G, 8344 A>G e deleção do DNAmt, além de fibroblastos de pacientes com suspeita de doença mitocondrial e com doença mitocondrial confirmada. Os controles utilizados foram: a linhagem derivada de osteosarcoma 143B e fibroblastos de um indivíduo normal. Observamos um aumento na produção de nitritos em todas as linhagens cíbridas e uma diminuição nos fibroblastos. A avaliação com o marcador DAF-FM diacetato mostrou marcação intracelular em todas as linhagens, com um aumento da marcação na linhagem com a mutação 8344 A>G e diminuição nos fibroblastos. A análise quantitativa mostrou um aumento significante da fluorescência obtida nas linhagens 8344 A>G e diminuição, também significante, nos fibroblastos. A nitração de proteínas foi verificada através do método de Western blotting utilizando o anticorpo anti-nitrotirosina, e amostras de células cíbridas, fibroblastos e de músculo esquelético. Não foram detectadas proteínas contendo nitrotirosinas, sugerindo que não houve nitração de proteínas nestas amostras. Nossos resultados sugerem que existe uma variação na síntese de NO em determinados defeitos da cadeia respiratória, sem indicações de lesão oxidativa decorrente de radicais de nitrogênio. Esta alteração pode sugerir a participação do NO no processo regulatório da mitocôndria frente ao defeito da cadeia respiratória. O conhecimento dos mecanismos deste processo regulatório pode ter implicações no tratamento das doenças mitocondriais e neurodegenerativas com envolvimento mitocondrial. / A mitochondrial production of nitric oxide (NO) hás been recently identified. Besides being a free radical, NO also participates in several physiological processes. NO itself is relatively non-reactive and exhibits an inhibitory effect on the respiratory chain, specially, cytochrome c oxidase (COX). NO can also be converted into a number of more reactive derivatives, which can lead to oxidative damage of several mitochondrial components, such as mitochondrial DNA (mtDNA), mitochondrial proteins and membranes. The existence of a mitochondrial nitric oxide synthase suggests that NO has an important regulatory role on mitochondrial function. The aim of this study was to evaluate nitric oxide synthesis in cell lines carrying different respiratory chain defects and to verify if there was protein nitration, which would indicate the presence of oxidative damage by nitrogen radicals. NO synthesis was verified through nitrite quantitation and using a fluorescent NO indicator, DAF-FM diacetate. We analyzed cybrid cell lines carrying mtDNA mutations 3243 A>G, 8344 A>G and mtDNA deletion, and fibroblasts from patients with confirmed and suspected mitochondrial disease. Control samples were: the cell line originated from osteosarcoma 143B and fibroblasts from a normal individual. We observed increased nitrite production in all cybrid cell lines and a decrement in all fibroblasts from patients. All cell lines showed intracellular fluorescence with DAF-FM diacetate. The quantitative analysis showed a significantly increase of the fluorescence obtained for the 8344 A>G cell line and a decrease in most of the fibroblasts. Protein nitration was verified through Western blotting method using the anti-nitrotyrosine antibody, in cybrid cells, fibroblasts and skeletal muscle. There was no detection of proteins containing nitrotyrosines, suggesting that these samples were not nitrated. Our results suggest a variation of nitric oxide synthesis in certain respiratory chain defects, without indication of oxidative damage as a consequence of nitrogen radicals. This variation can suggest NO involvement on mitochondrial regulatory process of respiratory chain defects. The knowledge of this regulatory process may have implications on treatment strategies of mitochondrial diseases and neurodegenerative diseases with mitochondrial involvement. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/9048 |
| Date | 31 December 2006 |
| Creators | Gamba, Juliana [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Tengan, Célia Harumi [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 126 p. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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