O camundongo mdx, modelo murino para a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) possui uma mutação de ponto no gene da distrofina que resulta na ausência da proteína no músculo, porém seu fenótipo é brando o que o torna um bom modelo genético e molecular, mas não um bom modelo funcional. Esperando obter um modelo para DMD que tivesse um fenótipo mais fiel ao apresentado pelos pacientes humanos, optou-se por transferir a mutação mdx para o background 129/Sv. Através de cruzamentos sucessivos foram obtidas 3 gerações de animais mdx com background 129/Sv (mdx129) e cada geração foi avaliada funcionalmente por 6 meses. Desde a primeira geração é possível observar que os animais mdx129 são mais fortes do que os mdx originais em background C57BL (mdxC57BL), sendo o oposto do esperado no início dos experimentos. O estudo então foi redirecionado para tentar entender o motivo dessa melhora. Em relação ao padrão histológico, em geral há diferenças entre o mdxC57BL e mdx129. Observa-se também que os animais mdx129 entram no processo de degeneração mais tardiamente que os animais mdxC57BL e seu processo de regeneração se estende por mais tempo. Através de estudos de microarray foi possível observar que os animais 129/Sv apresentam poucos genes diferencialmente expressos (GDEs) em relação aos animais C57BL, portanto os dois backgrounds são muito semelhantes. O mdxC57BL apresenta muito mais GDEs em relação ao seu selvagem (C57BL) do que o mdx129 em relação ao 129/Sv, entretanto, ambos os modelos apresentam mais genes superexpressos do que subexpressos, indicando que as alterações distróficas e regenerativas estão mais associadas com a ativação do que a repressão de genes. Quando os GDEs de ambos os modelos de mdx são distribuídos em categorias funcionais, há o predomínio de genes ligados ao sistema imune e quando essa categoria é omitida para melhor visualização das restantes, observa se que ambos os modelos apresentam categorias funcionais semelhantes, porém com proporções diferentes. No modelo mdx129 se destaca a diminuição da participação da categoria de rota endo/exocítica (tráfego de vesículas) e homeostase e aumento da participação das categorias de matiz extracelular e atividade enzimática. Cada modelo apresenta genes exclusivos, destacando os genes SPP1 e IL1RN na comparação 129/Sv x mdx129F3. O gene SPP1 codifica a proteína osteopontina (OPN) e o polimorfismo rs28357094 neste gene é utilizado como biomarcador de prognóstico para DMD. O papel da OPN na progressão da distrofia não é bem conhecido. Alguns estudos afirmam que a ausência dessa proteína melhora a força muscular de camundongos mdx, enquanto outros apontam que sua participação é necessária para a regeneração muscular. Assim sendo, mais estudos serão necessários para verificar qual seria a via responsável pela melhora fenotípica do modelo mdx129. Já o gene IL1RN codifica a proteína IL-1Ra, a qual é um antagonista de interleucina 1 (citocina pró-inflamatória e pró fibrótica). Portanto o aumento da expressão do gene de seu antagonista sugere que os animais mdx129F3 podem estar mais protegidos do processo inflamatório causado por essas moléculas. Quando analisadas as listas filtradas para músculo esquelético das comparações C57BL x mdxC57BL e 129/Sv x mdx129F3 para a formação de vias metabólicas, foi gerada apenas uma via em ambas as comparações com número relevante de moléculas. A via gerada pela análise da lista C57BL x mdxC57BL possui mais moléculas do que a via gerada pela analise da lista 129/Sv x mdx129F3, porém, todas as moléculas presentes nesta via, estão presentes na via C57BL x mdxC57BL, indicando que mesmo com número diferente de moléculas envolvidas, os genes participam das mesmas vias. Tanto a comparação de cada geração de mdx129 com o 129/Sv como a comparação das gerações entre si mostram que os efeitos da mudança de background estão presentes desde a primeira geração e não se alteram significativamente com os cruzamentos sucessivos. / The mdx mouse, murine model for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) has a point mutation in the dystrophin gene that results in the absence of the protein in the muscle, however its phenotype is mild, which makes it a good genetic and molecular model, but not a good functional model. Hoping to obtain a model for DMD with a phenotype that is more similar the patients\', it was chosen to transfer the mdx mutation to the 129/Sv background. Through successive breedings, 3 generations of mdx animals with 129/Sv background were obtained and each generation was functionally evaluated for 6 months. Since the first generation it is possible to observe that the mdx129 animals are stronger than the original mdx with C57BL background. The results were the opposite of what was expected in the beginning of the experiments, therefore the study was redirectioned to try to understand the reason of the improved phenotype. About the general histological pattern, there are differences between mdxC57BL and mdx129. It can be observed that the mdx129 animals enter the degenerative process later than the mdxC57BL animals and the regenerative process lasts longer. Through microarray studies it was possible to observe that the 129/Sv animals present few differentially expressed genes (DEGs) in comparison to the C57BL animals; therefore both backgrounds are very similar. The mdxC57BL presents many more DEGs in comparison to C57BL than mdx129 in comparison to 129/Sv, however both models present more super expressed genes than sub expressed, indicating that the dystrophic and regenerative alterations are more associated to the activation rather than the repression of genes. When the DEGs of both mdx models are distributed in functional categories, there is the predominance of genes related to the immune system and when this category is omitted for the better visualization of the remaining, it can be observed that both models present similar functional categories, but with different proportions. In the mdx129 model we can highlight the decrease in participation of the endo/exocytic pathway (vesicle traffic) and homeostasis categories, and increase in participation of the extracellular matrix and enzymatic activity categories. Each model presents exclusive genes, highlighting SPP1 and IL1RN in the comparison 129/Sv x mdx129F3. SPP1 encodes the protein osteopontina (OPN) and the polymorphism rs28357094 in this gene is used as a DMD prognostic biomarker. The role of OPN in the dystrophy progression is not well known. Some studies claim that the absence of OPN increases the muscle strength of the mdx mouse, while others indicate that its participation is necessary to muscle regeneration. More studies are needed to ascertain what pathway is responsible for the phenotypic improvement of the mdx129 model. The IL1RN gene encodes the protein IL-1Ra, and interleukin 1 antagonist, which is a pro-inflammatory and pro-fibrotic cytokine. Therefore, the increase in the expression of its antagonist suggests that the mdx129F3 animals may be more protected from the inflammatory process caused by these molecules. When the filtered lists for skeletal muscle of the comparisons C57BL x mdxC57BL e 129/Sv x mdx129F3 were analyzed for the formation of metabolic pathways, only one pathway was generated in both comparisons. The pathway generated in the analysis C57BL x mdxC57BL has more molecules that the one generated by the 129/Sv x mdx129F3 list, but all molecules present in the latter are also present in the former, indicating that even with different numbers of molecules involved, the genes participate in the same pathways. The comparisons of each generation of mdx129 with the 129/Sv and the comparison of the generations among each other show that the effects of the background change are present since the first generation and are not altered with the successive breedings.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17072015-142001 |
| Date | 07 April 2015 |
| Creators | Calyjur, Priscila Clara |
| Contributors | Vainzof, Mariz |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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