Οι α7 και α9 υπομονάδες των νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης (nAChRs) είναι
οι μόνες, ανάμεσα σε μια μεγάλη ποικιλία υπομονάδων του ανθρώπινου nAChR, που
σχηματίζουν ομοπενταμερείς υποδοχείς. Για την θεραπεία διαφόρων νευρολογικών
διαταραχών αλλά και άλλων ασθενειών, όπου εμπλέκονται οι α7 και α9 nAChRs,
απαιτούνται φαρμακευτικές ουσίες που θα στοχεύουν ειδικά σε έναν υπότυπο των nAChRs.
Για τον σχεδιασμό τέτοιων φαρμάκων είναι ουσιώδης η διαλεύκανση σε ατομικό επίπεδο
της δομής του nAChR. Εντούτοις, η κρυστάλλωση ολόκληρων των διαμεμβρανικών
υποδοχέων, αλλά ακόμη και η έκφραση και απομόνωσή τους, σε βαθμό που να επιτρέπει
δομικές μελέτες, έχει αποδειχθεί δύσκολος στόχος. Η δυσκολία έγκειται κυρίως στην
παρουσία υδρόφοβων διαμεμβρανικών περιοχών και στην μεγάλη ενδοκυττάρια περιοχή
που θεωρείται ευκίνητη και ότι δεν έχει σταθερή διαμόρφωση.
Στο πλαίσιο αυτό, στοχεύσαμε στην παραγωγή τμημάτων των α7 και α9 υπομονάδων
του nAChR, που να είναι κατάλληλα για αναλυτικές δομικές μελέτες, σχεδιάζοντας
κατασκευές για την έκφραση των εξωκυτταρικών περιοχών των δύο υπομονάδων ή και
κολοβών διαμεμβρανικών μορφών της α7 υπομονάδας. Σε αυτές έχουν απαλειφθεί είτε
τμήματα της μεγάλης ενδοκυτταρικής περιοχής, είτε ολόκληρη αυτή η περιοχή και μεγάλα
τμήματα της διαμεμβρανικής περιοχής.
Στο παρελθόν, είχε εκφραστεί η α7-ΕΚΠ στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης Pichia
pastoris και είχε οδηγήσει σε συσσωματώματα μεγάλου μοριακού βάρους, ενώ η έκφραση
ενός μεταλλάγματος της α7-ΕΚΠ έδειξε σημαντική βελτίωση της υδροφιλικότητας του
μορίου και σχηματισμό ολιγομερών κυρίως πενταμερών μορίων (Zouridakis et al. 2009). Σε
αυτήν την εργασία, έχουμε επιτύχει να απομονώσουμε τα σχηματιζόμενα πενταμερή μόρια
αυτού του μεταλλάγματος, εκμεταλλευόμενοι την ιδιότητα τους να εκλούονται σε μεγάλο
εύρος συγκέντρωσης ιμιδαζολίου, κατά την χρωματογραφία συγγένειας. Ακόμη, η ενζυμική
απογλυκοζυλίωση του μεταλλάγματος αυτού, βοήθησε στην περαιτέρω μείωση της
ετερογένειας των απομονωμένων πενταμερών μορίων. Αν και ο αρχικός έλεγχος συνθηκών
κρυστάλλωσης των γλυκοζυλιωμένων πενταμερών μορίων οδήγησε στον σχηματισμό
μικροκρυστάλλων, δεν στάθηκε δυνατή η βελτιστοποίηση της ανάπτυξής τους.
Η έκφραση της αγρίου τύπου εξωκυτταρικής περιοχής της α9 υπομονάδας του
ανθρώπινου nAChR (α9wt) στο ετερόλογο σύστημα έκφρασης P. pastoris, οδήγησε στην
παραγωγή κυρίως μονομερών μορίων που διαχωρίζονται εύκολα από τα σχηματιζόμενα
ολιγομερή. Η μονομερής μορφή της α9wt έδειξε αξιοσημείωτη διαλυτότητα, σταθερότητα και ομοιογένεια καθώς και ικανότητα πρόσδεσης της α-μπουγκαροτοξίνης, έναν ειδικό
ανταγωνιστή του μυικού και των ομοπενταμερών νευρικών nAChRs.
Προκειμένου να υποβοηθηθεί η συναρμολόγηση των εκφραζόμενων α7 και α9 ΕΚΠ
προς τον σχηματισμό πενταμερών μορίων, σχεδιάσαμε μεταλλάξεις που στηρίχθηκαν σε
τρισδιάστατα μοντέλα ομολογίας (3D homology modelling) αυτών, χρησιμοποιώντας ως
πρότυπο την κρυσταλλική δομή της ομόλογης, διαλυτής πρωτεΐνης δεσμεύσεως της
ακετυλοχολίνης (AChBP) από το μαλάκιο Lymnaea stagnalis. Οι μεταλλαγές αυτές έγιναν
είτε σε υδρόφοβα επιφανειακά αμινοξικά κατάλοιπα, με στόχο να αυξήσουμε την
υδροφιλικότητα του μορίου, είτε σε κατάλοιπα που εντοπίζονται στις διεπιφάνειες μεταξύ
δύο πρωτομερών, ώστε να ενισχύσουμε τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις και να
υποβοηθήσουμε την συναρμολόγηση τους προς πενταμερή μόρια. Τα προκύπτοντα
μεταλλάγματα έχουν ταύτιση αμινοξικής αλληλουχίας 70-95% με την αντίστοιχη του
αγρίου τύπου και σε ορισμένες περιπτώσεις η έκφρασή τους στην P. pastoris οδήγησε στον
σχηματισμό αλλά και την απομόνωση πενταμερών μορίων.
Η σάρωση των μεταλλαγμάτων απέτυχε στην ανεύρεση κάποιας συνθήκης
κρυστάλλωσής τους. Ωστόσο, ο αρχικός έλεγχος συνθηκών κρυστάλλωσης των μονομερών
μορίων της α9wt είχε ως αποτέλεσμα τον προσδιορισμό διαφορετικών συνθηκών όπου
σχηματίζονται πολλαπλοί κρύσταλλοι, τόσο για την γλυκοζυλιωμένη, όσο και την
απογλυκοζυλιωμένη μορφή της. Επιπλέον, η βελτιστοποίηση αυτών των κρυστάλλων στην
περίπτωση της γλυκοπρωτεΐνης, οδήγησε στο σχηματισμό μονοκρυστάλλων, που περιθλούν
ακτίνες-Χ σε ικανοποιητική ανάλυση, καθιστώντας αυτούς τους κρυστάλλους ως
υποσχόμενο υλικό για την επίλυση της δομής της άγριου τύπου α9 ΕΚΠ.
Τέλος, η έκφραση στην κυτταρική σειρά εντόμων Sf9 με το σύστημα των βακιλοϊών
της ολόκληρης α7 υπομονάδας του nAChR και των «κολοβών» διαμεμβρανικών μορφών
της οδήγησε στην ορθή στόχευση των σχηματιζόμενων υποδοχέων στην
κυτταροπλασματική μεμβράνη, ενώ οι φαρμακολογικές τους ιδιότητες προσεγγίζουν αυτές
του φυσικού α7 υποδοχέα. Παρά το γεγονός ότι η έκφραση των κατασκευών αυτών είχε
χαμηλή απόδοση και παρά τις δυσκολίες διαλυτοποίησης και απομόνωσής τους, ανάλυση με
χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού, για τουλάχιστον δύο από τα διαμεμβρανικά
μεταλλάγματα, δείχνει ότι οι διαλυτοποιημένες πρωτεΐνες έχουν σχηματίσει έναν πληθυσμό
ολιγομερών της πρωτεΐνης ο οποίος πιθανότατα αντιστοιχεί σε πενταμερή μόρια. Τα
παραπάνω, σε συνδυασμό με την απουσία της εύκαμπτης ενδοκυττάριας περιοχής,
καθιστούν αυτά τα α7 μεταλλάγματα, εφόσον ξεπεραστούν οι δυσκολίες της απόδοσης της
έκφρασης και της απομόνωσης τους, κατάλληλα για λειτουργικές και δομικές μελέτες. / The neuronal α7 and α9 subunits of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) are the only
amongst the known human nAChR subunits to form homopentamers, with five cholinergic
ligand-binding sites. Elucidation of their crystal structure is essential in order to design highly
specific drugs for treatment of several neurological diseases and disorders related to them and
will serve as the prototype for understanding the structure of all other members of the ligandgated
ion channel superfamily.
Crystallisation of the intact receptors is a difficult task to fulfil, partially due to their
hydrophobic transmembrane regions. Therefore, we aim at the expression of crystallisable
human α7 and α9 extracellular domains (ECDs) or truncated α7 forms lacking either only their
large and probably unordered intracellular domain or large parts of its transmembrane domain.
Regarding the α7 ECD, expression of the wild type form in yeast Pichia pastoris led into
formation of aggregates (Avramopoulou et al. 2004). Yet, a previously described mutant of this
ECD (α7m10, Zouridakis et al. 2009) succeeded in the formation of oligomers, mostly
corresponding to pentamers, due to improved solubility and subunit assembly of this mutant. In
this study, we managed to isolate apparently pentameric assemblies of the various expressed
oligomeric states, by optimizing its first-step purification procedure (metal affinity
chromatography), using a narrow stepwise increase of imidazole concentrations. In order to
further improve the protein homogeneity, we proceeded to the isolation of its deglycosylated
pentameric form. The relatively low polydispersity of both the glycosylated and deglycosylated
α7m10 ECDs, allowed for crystallization trials, which have resulted in microcrystallic
formations. Further optimization of these microcrystals failed.
As to the α9 ECD, expression of the wild type form in yeast Pichia pastoris led to the
formation of both monomers and a variety of oligomers. The monomeric α9 ECD showed
significant monodispersity, solubility and stability and exhibited binding ability of α-
bungarotoxin, a specific nAChR antagonist.
In order to facilitate the pentameric assembly and enhance the solubility of these α7 and α9
ECDs, we designed several mutants based on generated 3D homology models, using as template
the crystal structure of the homologous soluble molluscan acetylcholine binding protein
(AChBP). Several solvent accessible hydrophobic residues were replaced with more hydrophilic
ones and some interface-located residues were mutated so as to facilitate the formation of
additional inter-subunit interactions. The resulting mutants shared moderate and considerably high sequence identities (70-95%) with the wild type ECDs and in some cases, formation of
pentamers was accomplished.
Crystallisation screening for mutant ECDs failed in producing any hit. However, the pilot
crystallisation trials of monomeric wild-type α9 ECD resulted the formation of plate-like multi
crystals for both its glycosylated and deglycosylated forms. Further optimisation of these crystals
succeeded in producing single crystals of the glycoprotein, to produce single crystals, which
diffracted X-rays to satisfactory resolution, in a home source X-ray generator. Therefore, these
crystals seem to be a promising material for solving the wild type α9 ECD structure.
The intact and truncated α7 nAChRs under study were expressed in the Sf9/baculovirus
system and showed surface receptor expression, while presenting near-native ligand-binding
affinities for characteristic nAChR agonists and antagonists. Despite the low expression
yield and solubilisation and purification difficulties, gel filtration analysis for at least two
truncated mutants revealed the presence of a monodispersed oligomeric population,
probably corresponding to pentamers. All these, taken together with the lack of the flexible
large intracellular domain, render these α7 mutants, after overcoming the expression yield and purification difficulties, a suitable material for performing both functional and structural studies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/6972 |
| Date | 02 April 2014 |
| Creators | Ζαρκάδας, Ελευθέριος |
| Contributors | Τζάρτος, Σωκράτης, Zarkadas, Eleftherios, Πουλάς, Κωνσταντίνος, Πατρινός, Γεώργιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0033 seconds