Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon (DMHF) und 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon (DMMF), zwei wichtigen Aromakomponenten in Erdbeeren. Potentielle, mit stabilen Isotopen markierte Vorläufersubstanzen wurden an Erdbeeren appliziert und drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis über den erfolgreichen Einbau erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Anhand der Massenspektren von DMHF und DMMF, die aus den behandelten Erdbeeren mittels Festphasenextraktion isoliert wurden, konnte der Markierungsgrad der Verbindungen ermittelt werden und somit Rückschlüsse über die Effizienz der Metabolisierung der applizierten Zucker zu den beiden Furanonen DMHF und DMMF gezogen werden. Als mögliche Ausgangsstoffe dienten unterschiedlich markierte D-Glucose und D-Fructose, sowie Desoxyzucker, da diese als direkte Vorläufersubstanzen von DMHF und DMMF diskutiert werden. Isotopenmarkierte Desoxy-D-glucose oder Desoxy-D-fructose sind kommerziell nicht erhältlich, weshalb die Verbindungen [1-13C]-1-Desoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-Desoxy-D-glucose und [5,6,6,6-2H4]-6-Desoxyhexulose-1-phosphat zuerst synthetisiert werden mussten. Nach Applikation der Desoxyzucker wurde keine Erhöhung des Markierungsgrades an stabilen Isotopen gegenüber dem natürlichen Isotopenverhältnis festgestellt. Somit können 6-Desoxy-D-glucose, 1-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-D-fructose-1-phosphat als Prekursoren von DMHF und DMMF ausgeschlossen werden. Als gute Vorläufersubstanzen erwiesen sich D-Glucose und D-Fructose. Markierungen (13C und 2H) an Position C-1 oder C-6 der beiden Verbindungen wurden sowohl in DMHF als auch in dessen Methoxyderivat DMMF detektiert, wobei die Applikation von D-Fructose im Gegensatz zur D-Glucose einen höheren Markierungsgrad der Zielverbindungen zur Folge hatte. Durch den Einsatz positionsspezifisch markierter D-Glucose (2H-Markierung an Position C-1, C-2 oder C-4) sollten Aufschlüsse über den Metabolisierungsmechanismus gewonnen werden. Die Markierung der D-[2-2H]Glucose befand sich wie die der D-[1-2H]Glucose in den Methylgruppen der Furanone, was nur durch eine intramolekulare Verschiebung von C-2 nach C-1 erklärbar ist. Diese wurde bei der Glucosephosphatisomerase-katalysierten Umwandlung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat beobachtet. Somit muss D-Glucose bei der Biosynthese von DMHF und DMMF zuerst in diese Intermediate überführt werden. Im Gegensatz zu an Position C-2 markierter D-Glucose ging das Proton an Position C-4 im Laufe der Metabolisierung verloren. Demzufolge findet der in der Natur verbreitete Desoxygenierungsmechanismus von Monosacchariden nicht statt und schließt die Beteiligung von Desoxyzuckern an der Biosynthese von DMHF und DMMF gänzlich aus. Nach Einsatz von uniform markierter D-Fructose konnte sechsfach markiertes DMHF und DMMF identifiziert werden, was durch den Einbau der intakten Kohlenstoffkette zu erklären ist. Dieser Befund und weitere Untersuchungen mit verschiedenen Glykolyse-regulierenden Substanzen deuteten darauf hin, dass die Furanone dem zentralen Kohlenhydratstoffwechsel, der Glykolyse, entspringen. Vor der Aldolase-katalysierten Spaltung in zwei C3-Einheiten muss jedoch eine Abzweigung erfolgen, da sonst die Kohlenstoffkette nicht unverändert vorliegen könnte. Im zweiten Teil der Arbeit ist erstmals mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (OMT) aus Erdbeeren isoliert worden. Hierfür wurde mRNA aus reifenden Erdbeeren extrahiert und eine cDNA Bibliothek hergestellt. Diese wurde mit einer OMT-spezifschen Sonde durchmustert, welche durch PCR mit degenerierten Primern synthetisiert worden war. Nach mehreren Vereinzelungs-Zyklen konnte die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (STOMT, Strawberry OMT) erhalten werden. Northern-Analysen ergaben, dass die entsprechende RNA ausschließlich in den verschiedenen Reifestadien der Frucht akkumuliert, mit den höchsten Transkriptmengen in der rot-werdenden und reifen Frucht. In anderen Gewebeteilen wie Wurzel, Blätter, Stängel und Blüte konnte keine STOMT-RNA nachgewiesen werden. Das korrespondierende Protein zeigte hohe Homologien zu Kaffeesäure-OMTs aus Weidengewächsen der Gattung Populus. Nach erfolgreicher, heterologer Expression von STOMT in E. coli wurde die Substratspezifität des Enzyms untersucht, dessen Temperaturoptimum bei 30°C lag. Alle eingesetzten Substrate mit phenolischem Grundgerüst, wie Brenzcatechin, Kaffeesäure, Kaffeeoyl-CoA und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, aber auch das Furanonderivat DMHF wurden von der rekombinanten O-Methyltransferase umgesetzt. Als bestes Substrat erwies sich 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, das, im Gegensatz zu dessen Methylierungsprodukt Vanillin, bisher in Erdbeeren nicht nachgewiesen werden konnte. Kaffeesäure wurde ebenfalls effektiv methyliert, worin vermutlich die Hauptaufgabe von STOMT in der Pflanze liegt. Die Methylierung von Kaffeesäure oder 5-Hydroxyferulasäure ist ein wichtiger Prozess in der Entstehung von Lignin. Die Tatsache, dass Erdbeeren teilweise in den Leitbündeln und verstärkt in den Achenen lignifiziert sind, erklärt das Vorhandensein eines solchen Enzyms. DMHF, das als Dienol-Tautomer eine aromatische Struktur mit Hydroxylgruppen aufweist und somit strukturelle Ähnlichkeiten zu phenolischen Verbindungen zeigt, wurde ebenfalls von STOMT als Substrat akzeptiert. Die Bildung von DMMF, dem Methoxyderivat von DMHF erfolgte vergleichsweise langsam, war aber eindeutig auf die Methyltransferase-Aktivität zurückzuführen. STOMT ist aufgrund des Expressionsmusters als fruchtspezifisch und reifeinduziert einzustufen. Primäre Funktion ist vermutlich zu Beginn der Fruchtreifung die Lignifizierung der Leitbündel und später die der Achenen. Gleichzeitig scheint STOMT wesentlich an der Bildung der Aromastoffe DMMF und Vanillin in Erdbeeren beteiligt zu sein. / The present work reveals new insight in the biosynthesis of 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanone (DMHF) and 2,5-dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanone (DMMF), two important flavor compounds in strawberries. Isotopically labeled precursors were applied to detached strawberries and incubated for three days at room temperature. The successful incorporation of the isotopes was determined by gas chromatography-mass spectroscopy. On the basis of the mass spectra of DMHF and DMMF, isolated from treated strawberries by solid phase extraction, the ratio of labeled and unlabeled compounds was determined. Thus, the conversion of sugars to the furanones DMHF and DMMF could be analyzed in regard to efficiency of metabolism. Differently labeled D-glucose, D-fructose and deoxysugars were used as they are considered to be good precursors of DMHF and DMMF. [1-13C]-1-Deoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-deoxy-D-glucose and [5,6,6,6-2H4]-6-deoxyhexulose-1-phosphate had to be synthesized first since these isotopically labeled deoxysugars are not commercially available. After application of the labeled deoxysugars, the ratio of stable isotopes did not change in comparison with the natural isotopic ratio. As a consequence 6-deoxy-D-glucose, 1-deoxy-D-fructose and 6-deoxyhexulose-1-phosphate can be ruled out as precursors of DMHF and DMMF. D-Glucose and D-fructose were converted efficiently to the furanones. The isotopic label (13C and 2H) from position C-1 and C-6 of both carbohydrates was detected in DMHF and its derivative DMMF. In contrast to D-glucose, D-fructose was metabolized more efficiently to the target molecules as the furanones showed a higher degree of labeling. The use of D-glucose labeled at different positions should provide information about the mechanism of the biosynthesis. The label of D-[2-2H]glucose as well as that of D-[1-2H]glucose was recovered in the methyl group of the furanones. This observation was explained by an intra molecular isotope shift from position C-2 to C-1 which was observed in the course of the conversion of D-glucose-6-phosphate to D-fructose-6-phosphate mediated by phosphohexose isomerase. Consequently, D-glucose has to be transformed into these intermediates prior to the formation of DMHF and DMMF. In contrast to D-glucose, which was labeled at position C-2, the label at position C-4 was lost during the transformation. Therefore, the natural mechanism of deoxygenation might not occur during the biosynthesis of DMHF and DMMF. After application of D-[U-13C6]fructose the incorporation of six 13C atoms into DMHF and DMMF was detected. This implies that the complete carbon skeleton is incorporated. These findings and additional studies with different regulatory substances of the glycolysis indicated that the central metabolism of carbohydrates (glycolysis) is involved in the biosynthesis of furanones. Prior to the final cleavage into two C3-fragments by aldolase, another pathway has to branch off, as otherwise the skeleton can not remain unchanged. In the second part of the thesis the complete cDNA of a O-methyltransferase from strawberry was isolated by the means of molecular techniques. First, mRNA was extracted from turning strawberries to construct a cDNA library. An OMT specific fragment, synthesized by PCR with degenerated primers, was used as probe in order to screen the cDNA library. After few cycles of separation a complete cDNA coding for a putative O-methyltransferase (STOMT, strawberry OMT) was obtained. Northern analysis revealed high abundance in the different stages of fruit ripening while highest RNA levels were found in turning and ripe fruit. On the contrary, there were no STOMT-RNA transcripts in other tissue such as root, leaf, petiole and flower. The corresponding protein showed high homology to caffeic acid OMTs from Salicacea (Populus). STOMT was successfully expressed in E. coli in order to determine the substrate specificity. The enzyme showed highest activity at 30°C. All tested phenolic compounds such as catechol, caffeic acid, caffeoyl CoA and protocatechuic aldehyde as well as the furanone derivative DMHF were accepted by the recombinant O-methyltransferase. STOMT converted most rapidly protocatechuic aldehyde, which has not been detected in strawberry yet, to its methylated counterpart vanillin. Caffeic acid was also accepted to a high degree, which is probably the main function in strawberry. The methylation of caffeic acid and 5-hydroxyferulic acid is an important process in the formation of lignin. The fact that the vascular bundles contain lignin and the achenes are strongly lignified explains the presence of such an enzyme in strawberry. The dienolic tautomer of DMHF exhibiting an aromatic structure with two hydroxy groups shows structural homology to phenolic compounds. Therefore, DMHF was accepted as substrate by STOMT. Although the conversion proceeds quite slowly, unequivocally the methoxy derivative descends from DMHF by OMT activity. In accordance with its expression pattern in strawberry, STOMT is fruit specific and induced during ripening. In the course of the maturation, the primary function of STOMT is probably the lignification of the vascular bundles in the beginning and later that of the achenes. On the other hand, STOMT seems to be substantially involved in the biosynthesis of the flavor compounds DMMF and vanillin, too.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:229 |
| Date | January 2001 |
| Creators | Wein, Martina |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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