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Previous issue date: 2017-10-26 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Adenylosuccinate lyase (ASL) belongs to aspartase/fumarase superfamily of enzymes which share a general acid-base catalytic mechanism with ?-elimination of fumarate as common product. ASL is involved in both de novo and salvage pathways of purine biosynthesis. Cloning, expression, and a method to obtain homogeneous recombinant ASL from Leishmania braziliensis (LbASL) are described. Mass spectrometry analysis of recombinant LbASL, oligomeric state determination and multiple sequence alignment are presented. Steady-state kinetics of LbASL showed a Michaelis-Menten pattern. Isothermal titration calorimetry binding assays suggested that LbASL follows a Uni-Bi ordered kinetic mechanism, in which release of fumarate is followed by AMP to yield free enzyme. Initial velocity data for the reverse reaction and the Haldane relationship allowed calculation of an unfavorable equilibrium constant for LbASL-catalyzed chemical reaction. The activation energy and thermodynamic activation parameters were estimated. Solvent kinetic isotope effects V/K and V suggest a modest contribution of solvent proton transference during the rate-limiting step of the reaction. Proton inventory data show that the modest normal effect on V arises from a single protonic site, and the transition state fractionation factor value of 0.74 suggests participation of solvent proton transfer in transition-state vibrations perpendicular to the reaction coordinate. pH-rate profiles for kcat and kcat/KM suggested amino acid residues involved in, respectively, catalysis and substrate binding. A model of LbASL was built to provide a structural basis for the experimental data. A better understanding of the mode of action of LbASL is useful for the rational design of antileishmaniasis agents. / A enzima Adenilosuccinato liase (ASL) pertence a superfam?lia de enzimas aspartase/fumarase, as quais compartilham o mecanismo catal?tico ?cido-b?sico com ?-elimina??o de fumarato como o produto comum. A ASL est? envolvida tanto na bioss?ntese de novo quanto na via de salvamento de purinas. Aqui s?o descritos os m?todos de clonagem, express?o e obten??o da prote?na recombinante ASL de Leishmania braziliensis (LbASL) na sua forma homog?nea. An?lises da prote?na recombinante por espectrometria de massa, determina??o do estado oligom?rico e alinhamento m?ltiplo de sequ?ncias tamb?m s?o apresentados. Ensaios de cin?tica em estado estacion?rio mostraram que a LbASL segue o perfil de Michaelis-Menten. Experimentos de titula??o isot?rmica por calorimetria sugerem que a LbASL segue um mecanismo cin?tico Uni-Bi ordenado, no qual o fumarato ? liberado primeiro do s?tio ativo seguido pelo AMP. Dados de velocidade iniciais para a rea??o reversa e a rela??o de Haldane permitiram calcular uma constante de equil?brio desfavor?vel para a rea??o qu?mica catalisada pela enzima. Os par?metros de energia de ativa??o e termodin?mica tamb?m foram estimados. Os efeitos isot?picos do solvente V/K e V sugerem uma modesta contribui??o da transfer?ncia de pr?tons do solvente durante o passo limitante da rea??o. Os dados obtidos no invent?rio de pr?tons mostram um modesto efeito em V resultante de um ?nico s?tio prot?nico, e o valor de transi??o do fator de estado de fracionamento de 0,74 sugere a participa??o da transfer?ncia de pr?tons do solvente em vibra??es de estado de transi??o perpendiculares ? coordenada da rea??o. Experimentos de perfil de pH para kcat e kcat/KM sugerem os res?duos de amino?cidos envolvidos, respectivamente, na cat?lise e liga??o do substrato. A modelagem molecular para LbASL foi realizada visando prover uma base estrutural para interpreta??o dos dados experimentais. Um melhor entendimento do modo de a??o da LbASL ser? ?til para o desenho racional de agentes antileishmanioses.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2.pucrs.br:tede/7755 |
| Date | 26 October 2017 |
| Creators | Galina, Luiza |
| Contributors | Basso, Luiz Augusto |
| Publisher | Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul, Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular, PUCRS, Brasil, Faculdade de Bioci?ncias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 8198246930096637360, 500, 500, 500, 600, 36528317262667714, -1634559385931244697, 2075167498588264571 |
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