Derzeit fehlen detaillierte Informationen über die Beteiligung submuköser Neuronen an der Regulation der epithelialen Barriere im proximalen Colon des Schweines.
Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, die neurochemische Kodierung des inneren und äußeren submukösen Plexus (ISMP und ASMP) in diesem Darmabschnitt zu untersuchen. Dies bezeichnet deren Eigenschaft, entsprechend ihrer jeweiligen Funktion, eine individuelle Kombination von mehreren Neurotransmittern zu exprimieren. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurde die Anzahl von Neuronen ermittelt, welche Acetylcholin (Detektion via Cholin-Acetyl-Transferase (ChAT)), Stickstoffmonoxid ((NO) Detektion via neuronaler Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS)), Neuropeptid Y (NPY), Somatostatin (SOM), Substanz P (SP) und vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP) freisetzen können. Das zweite Ziel war es, ein Modellsystem zu entwickeln, in dem man die Wirkung der freigesetzten Neurotransmitter auf die Darmepithelzellen untersuchen kann. Hierzu wurde ein Protokoll zur in vitro-Kultivierung porziner Colon-Epithelzellen (CEZ) etabliert, welche die strukturellen Eigenschaften des polarisierten Colonepithels in vivo aufweisen. Als Parameter für die Barrierefunktion der CEZ diente der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER). Weiterhin wurde die Proliferationsaktivität der CEZ unter Neurotransmitter-Einfluss mittels Bromodesoxyuridin-ELISA bestimmt. Die Untersuchungen zur neurochemischen Kodierung offenbarten deutliche Unterschiede zwischen den beiden submukösen Plexūs. Während im ISMP überwiegend cholinerge und SP-positive Neurone zu finden waren, konnte im ASMP für jeden untersuchten Neurotransmitter mindestens ein Neuron pro Ganglion detektiert werden. Primäre CEZ konnten mittels Dispase bei 4°C isoliert und in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (4,5 g/L Glukose, 10 % Kälberserum) kultiviert werden. Der epitheliale Charakter der kultivierten Zellen konnte immunhistochemisch anhand der Expression des Tight junction-assoziierten Proteins Zonula occludens 1 und Epithelzell-typischen Cytokeratinen verifiziert werden. Die strukturelle und funktionelle Polarisierung der kultivierten CEZ war mittels Elektronen- und konfokal-mikroskopischen Aufnahmen als auch transepithelialen Potentialmessungen nachweisbar. NPY, SOM, SP und VIP übten keinen langfristigen Einfluss auf TEER und Proliferationsaktivität der CEZ aus. Im Gegensatz dazu steigerte der cholinerge Agonist Carbachol (CA) deutlich den TEER und hemmte leicht die Proliferationsaktivität der CEZ im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Der Effekt war jedoch nicht eindeutig konzentrationsabhängig. Der muskarinerge Rezeptorantagonist Atropin verhinderte nicht nur die CA-induzierten Effekte, sondern reduzierte selbst signifikant den TEER-Werte der CEZ. Dies weist auf eine autokrine Regulation der CEZ durch endogenes Acetylcholin hin. Die Applikation niedrigerer Konzentrationen des NO-Donors Sodium-Nitroprussid (SNP) erhöhte den TEER der CEZ gegenüber der unbehandelten Kontrolle, während höhere SNP-Dosen den TEER senkten.
Es wurden klare Indizien für die Beteiligung cholinerger ISMP-Neurone an der Kontrolle mukosaler Prozesse in vivo gefunden. NO scheint ebenfalls einen Effekt auf die epithelialen Barriere, zu haben, allerdings sind submuköse Neuronen als direkte Quelle unwahrscheinlich.:I. Inhaltsverzeichnis 1
II. Abkürzungen xi
1. Einleitung 1
1.1. Aufbau der epithelialen Barriere im Colon 2
1.2. Tight Junctions (TJs) 4
1.3. Der transepitheliale elektrische Widerstand als Parameter der epithelialen Integrität 7
1.4. Bau und Struktur des Enterischen Nervensystems (ENS) 10
1.5. Neurochemische Kodierung 13
1.6. Funktionen des ENS 17
1.7. Das ENS als möglicher Regulator epithelialer Funktionen 18
2. Zielstellung 23
3. Material und Methoden 25
3.1. Versuchstiere und Organentnahme 25
3.2. Versuchsabschnitt: Analyse der neurochemischen Kodierung im submukösen Plexus des porzinen proximalen Colons 25
3.2.1. Gewebekultur 25
3.2.2. Gewebepräparation 26
3.2.3. Immunhistochemie 26
3.2.4. Spezifität der Antikörper 28
3.2.5. NADPH-Diaphorase-Färbung 28
3.2.6. Bestimmung der neuronalen Dichte 29
3.2.7. Bestimmung der absoluten Häufigkeiten immunreaktiver Neurone 29
3.2.8. Analyse der neurochemischen Kodierung 29
3.2.9. Gefrierschnitte 31
3.2.10. Statistische Auswertung 32
3.3. Versuchsabschnitt: Einfluss submuköser Neurotransmitter auf den TEER und die Proliferation im porzinen Colonepithel 33
3.3.1. Etablierung einer primären Colon-Epithelzellkultur 33
3.3.1.1. Isolation von Colonepithelzellen mit Dispase II 33
3.3.1.2. Zellkulturmedien 34
3.3.1.3. Aussaat 35
3.3.1.4. Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) 35
3.3.1.5. Potentialmessungen 37
3.3.1.6. Proliferationsassay 38
3.3.1.7. Immunhistochemische Färbungen von kultivierten Colonepithelzellen 38
3.3.1.8. Mikroskopische Analyse der Präparate 40
3.3.1.9. Beurteilung der ZO-1/Fibronektin-Konfluenz 40
3.3.1.10. Konfokal-Mikroskopie 40
3.3.1.11. Rasterelektronenmikroskopie (REM) 40
3.3.1.12. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 40
3.3.2. Untersuchung des Einflusses von enterischen Neurotransmittern auf den TEER und die Proliferation primär kultivierter, porziner Colonepithelzellen 41
3.3.2.1. Einfluss enterischer Neurotransmitter auf den TEER kultivierter CEZ 41
3.3.2.2. Einfluss enterischer Neurotransmitter auf die Proliferation von kultivierten CEZ 42
3.3.2.3. Molekularbiologische Analyse 42
3.3.2.4. Darstellung der Ergebnisse und Statistische Auswertung 44
4. Ergebnisse 47
4.1. Analyse der neurochemischen Kodierung im submukösen Plexus des porzinen proximalen Colons 47
4.1.1. Neuronale Dichte und allgemeine Struktur der submukösen Plexūs im porzinen Colon 47
4.1.2. Absolute Anzahl immunreaktiver Neurone im submukösen Plexus des porzinen Colons 48
4.1.3. Neurochemisch identifizierte Subpopulationen im ISMP 53
4.1.4. Neurochemisch identifizierte Subpopulationen im ASMP 56
4.1.5. Projektionen neuronaler Fasern 57
4.1.6. Zusammenfassung der Ergebnisse des ersten Versuchsabschnittes 62
4.2. Einfluss submuköser Neurotransmitter auf den TEER und die Proliferation im porzinen Colon 63
4.2.1. Etablierung und Charakterisierung einer primären Colon-Epithelzellkultur 63
4.2.1.1. Zellkulturmedien 63
4.2.1.2. Modulierbarkeit des TEER 69
4.2.1.2. Epithelialer Charakter der kultivierten CEZ 71
4.2.1.3. Korrelation von TEER und CEZ- bzw. Fibroblasten-Konfluenz 73
4.2.1.4. Polarisierung der kultivierte CEZ 76
4.2.2. Untersuchung des Einflusses von enterischen Neurotransmittern auf den TEER und die Proliferation von primär kultivierten, porzinen Colonepithelzellen 82
4.2.2.1. Einfluss enterischer Neurotransmitter auf den TEER kultivierter CEZ 82
4.2.2.2. Einfluss enterischer Neurotransmitter auf die Proliferation von kultivierten CEZ 86
4.2.2.3. Modulation des Carbachol-Effektes auf den TEER und die Proliferation von kultivierten CEZ 88
4.2.2.4. Molekularbiologische Analyse 91
5. Diskussion 93
5.1. Analyse der neurochemischen Kodierung im submukösen Plexus des porzinen proximalen Colons 93
5.1.1. Methodische Aspekte 93
5.1.2. Allgemeine Struktur und neuronale Dichte der submukösen Plexūs im porzinen Colon 94
5.1.3. Neurochemische Kodierung im ISMP des porzinen Colons 96
5.1.3.1. ACh/ChAT im ISMP 97
5.1.3.2. SP im ISMP 97
5.1.3.3. nNOS im ISMP 98
5.1.3.4. VIP im ISMP 99
5.1.3.5. SOM im ISMP 100
5.1.3.6. NPY im ISMP 101
5.1.4. Neurochemische Kodierung im ASMP des porzinen Colons 101
5.1.4.1. ACh/ChAT und SP im ASMP 102
5.1.4.2. nNOS im ASMP 103
5.1.4.3. VIP im ASMP 104
5.1.4.4. SOM im ASMP 104
5.1.4.5. NPY im ASMP 105
5.1.5. Nicht identifizierte Neurone 105
5.1.6. Vergleich zur Situation im humanen Colon 106
5.2. Einfluss submuköser Neurotransmitter auf den TEER und die Proliferation im porzinen Colon 109
5.2.1. Etablierung einer primären Colon-Epithelzellkultur 109
5.2.1.1. Isolationsmethoden und Zellkulturmedien 109
5.2.1.2. Epithelialer Charakter der kultivierten CEZ 115
5.2.2. Untersuchung des Einflusses enterischer Neurotransmitter auf den TEER und die Proliferation von primär kultivierten porzinen Colonepithelzellen 117
5.2.2.1. TEER unbehandelter Zellen 117
5.2.2.2. Carbachol-Effekte 118
5.2.2.2.1. Einfluss von Carbachol auf den TEER-Wert 118
5.2.2.2.2. Einfluss von Carbachol auf die Proliferation 122
5.2.2.3. NO-Effekte 123
5.2.2.3.1. Einfluss von SNP auf den TEER-Wert 123
5.2.2.3.2. TEER-Anstieg unter niedrigen SNP-Konzentrationen 124
5.2.2.3.3. TEER-Senkung unter höheren SNP-Konzentrationen 126
5.2.2.3.4. Einfluss von SNP auf die Proliferation 130
5.2.2.3.5. Quelle für NO in vivo 130
5.2.2.4. Effekte von NPY, Substanz P, Somatostatin und VIP 133
6. Zusammenfassung 139
7. Summary 145
8. Literaturverzeichnis 151
9. Selbstständigkeitserklärung 167
10. Wissenschaftlicher Werdegang 169
12. Danksagung 175
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:88550 |
| Date | 08 December 2023 |
| Creators | Petto, Carola |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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