Limitierend für pharmakologische Therapien ist oft die Unfähigkeit des Wirkstoffes, biologische Membranen zu überwinden, weswegen häufig Transportmoleküle wie z.B. zellpenetrierende Peptide (CPPs, cell penetrating peptides) benutzt werden. Von den über 100 beschriebenen CPPs wurde bisher nur eine kleine Anzahl systematisch verglichen, was die Auswahl des „richtigen“ CPPs für eine Anwendung erschwert. Ziel dieser vorliegenden Arbeit war es, das pro-apoptotische Peptid KLA mittels CPPs spezifisch in Krebszellen zu transportieren. Untersucht wurden: (I) Verschiedene CPPs in unterschiedlichen Zelltypen zur Selektion der „besten“ CPPs; (II) Der Einflusses des CPP C-Terminus auf die Internalisierung und zelluläre Verteilung; (III) Der zelluläre KLA-Transport mittels CPPs via einer nicht-kovalenten Administration. 22 verschiedene CPPs wurden in sieben Zelltypen untersucht, wobei Toxizität, Zellaufnahme und zelluläre Lokalisation mittels Fluorescein markierten CPPs in Fluoreszenzspektroskopie und konfokaler Mikroskopie betrachtet wurden. Abhängig von der Zellaufnahme wurden die CPPs in drei Gruppen klassifiziert. Die Untersuchung carboxylierter und carboxyamidierter CPP C-Termini ergab, dass in den meisten Fällen ein Carboxyamid die zelluläre Aufnahme begünstigte. Drei CPPs (MPG, Penetratin und Integrin) wurden ausgewählt, um das pro-apoptotische KLA Peptid in zwei Krebszelllinien (MCF-7 Brustkrebszellen und leukämische RAW264.7 Makrophagen) im Vergleich zu Fibroblasten (Cos-7) nicht-kovalent zu transportieren. Der erfolgreiche KLA-Transport hing vom CPP, dessen C-Terminus und der Zelllinie ab. Die Analyse der Viabilität nach CPP:KLA Administration ergab, dass MPG-CONH2:KLA (1:2) toxisch für Makrophagen und Brustkrebszellen, aber nicht für Fibroblasten war. Die Toxizität konnte der Apoptose zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Informationen über die Auswahl des passenden CPPs für den nicht-kovalenten Transport des pro-apoptotischen KLA-Peptids. / Limitations in a pharmacological therapy are often due to the inability of drugs to overcome the cell membrane and therefore transporting molecules are being used, e.g. cell penetrating peptides (CPPs). Only a few of the over 100 described CPPs have been compared systematically making the choice of “the” CPP for a given application difficult. The goal of the presented work is the CPP mediated delivery of the pro-apoptotic peptide KLA in breast cancer cells as proof of principle for a therapeutical application. Analysed were (I) Different CPPs in various cell types to select the “best” one, (II) The influence of the CPP C-termini on uptake and localisation, (III) The cellular KLA delivery via a non-covalent CPP administration. 22 CPPs were compared in seven cell types thereby looking at toxicity, cellular uptake and subcellular localisation using fluorescein labelled CPPs for fluorescence spectroscopy and confocal microscopy. The resulting uptake information allowed the classification of the CPPs in three main groups. The evaluation of carboxylated and carboxyamidated CPP C-termini revealed that a carboxyamide mostly enhanced the cellular CPP uptake. Three CPPs were selected (MPG, penetratin and integrin) to deliver the pro-apoptotic KLA peptide in two cancer cell lines (breast cancer MCF-7 cells and RAW264.7 macrophages) compared to fibroblasts (Cos-7) via the non-covalent strategy. A successful KLA delivery depended on the applied CPP, its C-terminus and the used cell line. The biological activity of the pro-apoptotic KLA peptide was determined via the cell viability (MTT assay). The co-incubation of MPG-CONH2:KLA (1:2) was able to induce toxicity in breast cancer cells and leukaemic macrophages, but not in fibroblasts. The viability reductions were then assigned to apoptosis. This work provides important information for the choice of an adequate CPP for the pro-apoptotic KLA peptide delivery and presents the advantage of the non-covalent delivery strategy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/17241 |
| Date | 27 September 2012 |
| Creators | Müller, Judith |
| Contributors | Volk, Hans-Dieter, Herrmann, Andreas, Grütz, Gerald |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung, http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/ |
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