Shiga Toxin produzierende Escherichia coli (STEC) sind wichtige Erreger von Lebensmittelinfektionen und gelten als Hauptverursacher für die Ausbildung einer hämorrhagischen Colitis und dem lebensbedrohlichen hämolytisch-urämischen Syndrom. Als Hauptvirulenzfaktor und wichtigstes Charakteristikum der STEC wird die Fähigkeit angesehen, Shiga Toxine (Stx) zu produzieren. Die genetische Information für deren Produktion ist im Genom lambdoider Prophagen kodiert. Eine Antibiotikatherapie bei STEC-assoziierten Infektionen wird sehr kontrovers diskutiert, da sowohl die Produktion der Stx als auch die Freisetzung der Bakteriophagen in vitro durch antibiotisch wirkende Substanzen stimuliert werden kann. Der enterohämorrhagische E. coli O157:H7 Stamm EDL933 beherbergt insgesamt 18 lambdoide Prophagen und prophagenähnliche Elemente, darunter den Stx1-kodierenden Phagen CP-933V und den Stx2-kodierenden Phagen BP-933W. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss des Gyrasehemmers Norfloxacin auf das Gesamttranskriptom von EDL933 mit Hilfe der DNA-Microarraytechnologie und unter Verwendung des MWG E. coli O157 Arrays umfassend zu untersuchen und insbesondere die Expression der Prophagengene zu analysieren. Hierfür wurde der E. coli O157:H7 Stamm EDL933 mit 200 ng/ml Norfloxacin inkubiert, Gesamt-RNA isoliert und diese mittels reverser Transkription in cDNA synthetisiert, wobei ein Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden erfolgte. Diese cDNA wurde mit den auf dem E. coli O157 Array befindlichen Oligonukleotiden hybridisiert. Die Auswertung der Fluoreszenzintensitäten ermöglicht eine Analyse der Genexpression. Infolge der Induktion von EDL933 mit 200 ng/ml Norfloxacin zeigten 118 Spots eine Hochregulation und 122 eine Deregulation von Genen an. Bei genauerer Betrachtung resultierte auf Grund der Inkubation mit Norfloxacin eine erhöhte Expression von 52 Genen der Stx-kodierenden Phagen CP-933V und BP-933W. Insbesondere erfolgte eine erhöhte Regulation von Genen der späten Region des BP-933W. Das stxA2-Gen wurde dabei im Vergleich zur nicht-induzierten Kultur 158-fach stärker exprimiert. Im Falle des Stx1-Phagen wiesen nur einige Gene der frühen Region eine gesteigerte Genaktivität auf. Auffallend war die Hochregulation einzelner Gene der nicht Stx-kodierenden Phagen. Gene des Primärstoffwechsels, u. a. Gene der Aminosäurebiosynthese, des Energiehaushaltes und der Zellteilung zeigten eine verminderte Genaktivität nach Induktion. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die verwendete Konzentration von Norfloxacin große Auswirkungen auf das Gesamttranskriptom des untersuchten Stammes haben und insbesondere die Genexpression von zehn im Genom des EDL933 befindlichen Prophagen erhöht wurde. Die durch die Microarrayversuche erhaltenen Expressionsraten wurden durch Quantifizierung der cDNA mittels RT Real-Time PCR Untersuchungen überprüft. Zusammenfassend ist festzustellen, dass Norfloxacin neben der antibiotischen Wirkung in der hier verwendeten geringen Konzentration multiple Effekte auf E. coli O157:H7 ausübt und die Auswirkungen in Zukunft noch detaillierter untersucht werden müssen. Die DNA-Microarraytechnologie und der kommerziell erhältliche E. coli O157 Array ermöglichen diese umfassenden Analyse des Transkriptionsprofils. Im Rahmen dieser Arbeit konnte diese Technologie für Untersuchungen der Genexpression von E. coli O157 etabliert und validiert werden. / Infection with Shiga toxin producing Escherichia coli (STEC) is a serious cause of bloody diarrhea and sporadic cases and outbreaks of food-related diseases such hemorrhagic colitis and the hemolytic uremic syndrome (HUS) worldwide. The use of antibiotics in therapy of STEC-associated diseases has been discussed controversially. Release of phage-encoded Shiga toxins is the major virulence factor of enterhemorrhagic Escherichia coli (EHEC). The genome of the EHEC strain E. coli O157:H7 EDL933 contains 18 prophages or prophages elements, including the Stx1- and Stx2-encoding phages CP-933V and BP-933W. Stx-production and Stx-prophage induction can be stimulated by certain antibiotics, e.g. mitomycinC or UV light. The aim of this study was to investigate the influence of a low concentration of the gyrase inhibitor norfloxacin on the whole transcriptom of E. coli O157:H7 strain EDL933 and particularly on the gene expression of prophages using the DNA-microarraytechnology and the commercial available MWG E. coli O157 Array. To determine this, E. coli O157:H7 cultures were incubated with 200 ng/ml norfloxacin. Total RNA was isolated and labelled with fluorescence dyes during reverse transcription. Following this, the labelled cDNA was hybridized with the commercial E. coli O157 Arrays and the fluorescence intensities were measured, analysed and evaluated with appropriate software. Results of this study have indicated that a low concentration of norfloxacin have profound effects on the trancriptome of E. coli O157:H7. Under the conditions applied (200 ng/ml norfloxacin) and an incubation time of 120 minutes, 118 spots indicated a transcriptional upregulation and 122 spots a transcriptional downregulation of E. coli O157:H7 genes present on the array. In detail, 85 spots could be ascribed to EDL933 phage genes. Fifty-two of them could be assigned to the Shiga toxin encoding phages CP-933V and BP-933W, the others belonged to the non-Stx encoding phages or prophages elements existing in the EDL933 genome. Conspicuous, genes present in the late region of the BP-933W prophage were induced most strongly, up to 158-fold in the case of stxA2. Only some genes present in the early region of the Stx1 encoding phage CP-933V were induced upon induction with norfloxacin. Notably, only some genes of the non-Stx phages of EDL933 appeared to be induced after induction. The additional upregulated genes were related to recombination and stress functions and to E. coli O157:H7 RIMD0509952 genes. The majority of downregulated genes belonging to primary metabolism, such as amino acid biosynthesis, cell division and energy metabolism. In conclusion, an induction of E. coli O157:H7 strain EDL933 with 200 ng/ml norfloxacin has profound effects on the transcriptome of E. coli O157:H7, in particular on the global gene expression of more then ten prophages. The DNA-microarray technology and especially the E. coli O157 Array offer a modern tool for analysis of transcription profiles of the serious pathogen EHEC O157 in response to stress, e.g. antibiotics. In the context of this work, the DNA-microarraytechnology could be established and validated to provide the opportunity for further studies about the global effects on the whole transcriptome of E. coli O157.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:swb:14-1137946605371-64953 |
| Date | 31 December 2005 |
| Creators | Herold, Sylvia |
| Contributors | Technische Universität Dresden, Mathematik und Naturwissenschaften, Chemie und Lebensmittelchemie, Institut für Lebensmittelchemie, Prof. Dr. Herbert Schmidt, Prof. Dr. Thomas Henle, Prof. Dr. Herbert Schmidt, Prof. Dr. Helge Karch |
| Publisher | Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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