Embora os insetos sejam essenciais para a vida na Terra, alguns afetam negativamente a sociedade humana atuando como vetores de doenças, como por exemplo a doença de Chagas. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, no Brasil, o método mais eficaz para prevenir a propagação do agente etiológico, Trypanosoma cruzi, é por controle vetorial. Rhodnius prolixus é um importante vetor de doença de Chagas no Brasil. Como outros insetos, seu comportamento depende de semioquímicos percebidos por um sistema olfativo sofisticado. As proteínas que realizam a comunicação entre ambiente externo e os receptores de odorantes são chamadas de proteínas ligadoras ao odorante (Odorant Binding Protein, OBPs), e são proteínas solúveis, extracelulares e pequenas (15-17 kDa). Visando aumentar o conhecimento sobre essas proteínas para possivelmente desenvolver estratégias de manipulação comportamental de R. prolixus, foram selecionados três genes putativos de OBPs, RproOBP 8, 11 e 19. Os genes foram selecionados através de ferramentas de bioinformática e foram clonados e expressos em diferentes vetores linhagens celulares de Escherichia coli. A proteína recombinante RproOBP 8 e 11 foram expressas em E. coli BL21(DE3). A RproOBP 19 obteve os melhores resultados quando expressa em E. coli BL21(DE3)pLysS. As proteínas recombinantes foram estudadas usando Espalhamento Dinâmico da Luz (DLS), cujos resultados sugeriram melhores soluções tamponantes para trabalhar e armazenar essas proteínas. Esses tampões também foram utilizados para rastrear as condições de cristalização. Embora não tenham sido obtidos cristais para serem usados em coleta de dados de difração de raios X, algumas condições se mostraram promissoras para serem refinadas posteriormente. A RproOBP11 apresentou uma cor vermelha quando purificada. O espectro de UV-Visível mostra um máximo de absorção em 413 nm, o que sugere a presença de um grupo heme no estado oxidado. Os espectros obtidos por Dicroísmo Circular (CD) para a RproOBP11, caracterizam uma proteína rica em α- hélice devido aos picos negativos em 208 e 222 nm. Na presença de 5 possíveis ligantes: pentanol, hexanol, heptanol, octenol e octanol, os espectros de CD não mostraram mudança, podendo representar falta de interação ou interações fracas. A Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) foi realizada com os mesmos compostos, nenhum deles mostrou interação com a RproOBP11 em tampão 20 mM fosfato pH 7,0. Os mesmos resultados de ITC foram obtidos para o RproOBP19 em tampão 20 mM HEPES pH 7,0. Os resultados do CD sugerirem que o RproOBP19 é uma proteína com regiões intrinsecamente desordenadas. Quando os espectros de CD foram obtidos na presença de TFE a RproOBP19 apresenta espectro mais semelhante às proteínas de α- hélice. Estes resultados representam a primeira investigação molecular de OBPs de R. prolixus. Testes adicionais são necessários para descobrir a estrutura e função dessas OBPs e assim, realizar uma abordagem direcionada do controle vetorial e a possibilidade de usar essas pequenas proteínas como ferramentas biotecnológicas. / Although insects are essential to life on earth, some can affect negatively human society acting as vectors of diseases. One of those is Chagas disease. According to the World Health Organization, in Brazil the most effective method to prevent the spread of the etiologic agent, Trypanosoma cruzi, is by vector control. Rhodnius prolixus is important Chagas disease vector in Brazil. It is a blood-feeding triatomine whose behavior, like other insects, originally depends of signals given by the environment as semiochemicals perceived by a sophisticated olfactory system. The proteins that perform the communication between external environment and the odorant receptors are called Odorant Binding Proteins (OBPs), and are soluble, extracellular and small proteins (15-17 kDa). Aiming to increase knowledge about these proteins to possibly develop strategies for behavioral manipulation of R. prolixus , three putative OBP genes, RproOBP 8, 11 and 19, were selected. The genes were selected using bioinformatics tools and were cloned and expressed in different vectors of Escherichia coli cell lines. Recombinant protein RproOBP 8 and 11 were expressed in E. coli BL21(DE3). RproOBP 19 obtained the best results when expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS. Recombinant proteins were studied using Dynamic Light Scattering (DLS), whose results suggested better buffering solutions for working and storing conditions. Such buffers were also used to track crystallization conditions. Although no crystals have been obtained for use in X-ray diffraction data collection, some conditions have proved promising for further refinement. RproOBP 11 showed a red color when purified. The UV-Visible spectrum shows a maximum absorption at 413 nm, which suggests the presence of a heme group in the oxidized state. The spectra obtained by Circular Dicroism (CD) for RproOBP11, characterize an α-helix rich protein due to negative peaks at 208 and 222 nm. In the presence of 5 possible ligands: pentanol, hexanol, heptanol, octenol and octanol, the CD spectra did not show change, being able to represent lack of interaction or weak interactions. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) was performed with the same compounds, none of them showed interaction with RproOBP 11 in 20 mM phosphate buffer pH 7.0. The same ITC results were obtained for RproOBP19 in 20 mM HEPES buffer pH 7.0. CD results suggest that RproOBP19 is a protein with intrinsically disordered regions. When CD spectra were obtained in the presence of TFE RproOBP19 presents a spectrum more similar to the α-helix proteins. These results represent the first molecular investigation of OBPs of R. prolixus. Further tests are needed to uncover the structure of these OBPs and provide insight into the function allowing a more targeted approach of vector control and the possibility to use such small proteins as biotechnological tools.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17092018-092543 |
| Date | 23 May 2018 |
| Creators | Sampaio, Renata Porto |
| Contributors | Thiemann, Otavio Henrique |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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