Extracellular signals are translated and amplified via cascades of serially switched protein kinases, MAP kinases (MAPKs). One of the MAP pathways, the classical RAS/RAF/MEK/ERK pathway, transduces signals from receptor tyrosine kinases and plays a central role in regulation of cell proliferation. RAF kinases (A-, B- and C-RAF) function atop of this cascade and convert signals emanating from conformational change of RAS GTPases into their kinase activity, which in turn phosphorylates their immediate substrate, MEK. Disregulated kinase activity of RAF can result in tumor formation, as documented for many types of cancer, predominantly melanomas and thyroid carcinomas (B-RAF). A-RAF is the least characterized RAF, possibly due to its low intrinsic kinase activity and comparatively mild phenotype of A-RAF knockout mice. Nevertheless, the unique phenotype of araf -/- mice, showed predominantly neurological abnormalities such as cerebellum disorders, suggesting that A-RAF participates in a specific process not complemented by activities of B- and CRAF. Here we describe the role of A-RAF in membrane trafficking and identify its function in a specific step of endocytosis. This work led to the discovery of a C-terminally truncated version of A-RAF, AR149 that strongly interfered with cell growth and polarization in yeast and with endocytosis and actin polymerization in mammalian cells. As this work was in progress two splicing isoforms of ARAF, termed DA-RAF1 and DA-RAF2 were described that act as natural inhibitors of RAS-ERK signaling during myogenic differentiation (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 contains the first 153 aa of A-RAF and thus is nearly identical with AR149. AR149 localized specifically to the recycling endosomal compartments as confirmed by colocalization and coimmunoprecipitation with ARF6. Expression of AR149 interferes with recycling of endocytosed transferrin (Tfn) and with actin polymerization. The endocytic compartment, where internalized Tfn is trapped, was identified as ARF6- and RAB11- positive endocytic vesicles. We conclude that the inhibition of Tfn trafficking in the absence of A-RAF or under overexpression of AR149 occurs between tubular- and TGNassociated recycling endosomal compartments. siRNA-mediated depletion of endogenous A-RAF or inhibition of MEK by U0126 mimic the AR149 overexpression phenotype, supporting a role of ARAF regulated ERK signalling at endosomes that is controlled by AR149 and targets ARF6. Our data additionally suggest EFA6 as a partner of A-RAF during activation of ARF6. The novel findings on the A-RAF localization and the interaction with ARF6 have led to a new model of ARAF function were A-RAF via activation of ARF6 controls the recycling of endocytic vesicles.Endocytosis and rapid recycling of synaptic vesicles is critically important for the physiological function of neurons. The finding, that A-RAF regulates endocytic recycling open a new perspective for investigation of the role of A-RAF in the nervous system. / Extrazelluläre Signale werden über eine Serie von nacheinander geschalteten Proteinkinasen, den MAP-Kinasen (MAPK) weitergeleitet und multipliziert. Einer der MAPK-Signalwege, der RAS/RAF/MEK/ERK-Signaltransduktionsweg, leitet Signale von Tyrosinkinaserezeptoren weiter und spielt eine zentralle Role in der Regulation der Zellproliferation. RAF Kinasen (A-, B-, und CRAF) stehen am Anfang der Kaskade. Sie wandeln die signalbedingte strukturellen Änderungen der RAS-GTPase in ihre Kinaseaktivität um und phosphorylieren ihr direktes Substrat, MEK. Eine Störung in der Regulation der Kinaseaktivität des RAF-Proteins kann zur Tumorbildung führen, wie es bei vielen Krebsarten, vor allem Melanom und Schilddrüsenkarzinom (B-RAF), dokumentiert ist. A-RAF ist die bislang am wenigsten charakterisierte RAF-Kinase, möglicherweise aufgrund sihrer nidrigen intrinsischen Kinaseaktivität. Weiterhin weist die A-RAF defficiente Maus einen relativ milden hauptsächlich neuronalen Phänotyp auf, der sich unter anderem auch in einer Fehlfunktion des Cerebellums manifestiert. Dieser einzigartige Phänotyp weist darauf hin, dass eine Reihe zellulärer Prozesse spezifisch durch A-RAF und nicht durch aktiveren B- und C-RAF vermittellt wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle des A-RAF-Proteins im intrazellulären Membrantransport analysiert und eine spezifische A-RAF Funktion by endozytotischen Prozessen identifiziert. Diese Arbeit führte zur Entdeckung einer C-terminal verkürtzten Form von A-RAF, AR149, welche das Wachstum und die Polarisation von Hefezellen beeinträchtigt. In Säugetierzellen wirkt AR149 störend auf die Endozytose und die Aktinpolymerisation. Während des Entstehungsprozesses dieser Studie, wurden parallel zwei Spleißisoformen des A-RAF-Proteins, DARAF1 und 2, publiziert, die als natürliche Inhibitoren des RAS-RAF-MEK-ERK-Signalwegs in der myogenen Differenzierung agieren (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 beinhaltet die ersten 153 Aminosäuren des A-RAF Proteines und ist damit fast identisch mit AR149. Eigene Kolokalisierungund Koimmunopräzipitationsexperimente mit ARF6 weisen darauf hin, dass AR149 spezifisch in ARF6-positiven Recycling-Endosomen lokalisiert ist. Expression des AR149 Proteins bechindert das Recycling von endozytiertem Transferrin und die Aktin Polimerisation. Die endosomalen Kompartimente in denen internalisiertes Transferrin gefangen vor liegt, konntenals ARF6- und RAB11-positive endozytotische Vesikeln characterisiert werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine durch A-RAF Überexpression bzw. durch die Abwesenheit an A-RAF vermittelte Blokade des intrazellulären Transferrintransportes zwischen den tubulären- und Trans-Golgi-Netzwerk-assoziirten endosomalen Recycling-Kompartimenten schließen. Inhibierung der endogenen A-RAF-Expression durch siRNA oder Hemmung der MEK-Aktivität durch U0126 haben den selben Effekt wie AR149. Auf der Basis dieser Ergebnisse wird ein neues Modell für die Rolle der A-RAF regulierten ERK Signallwirkung auf Endosomen vorgestellt, bei dem das Zielprotein die ARF6 GTPase durch 3 AR149/DA-RAF2 negativ reguliert wird. Daruber hinaus deuten unsere Daten darauf hin, dass EFA6, ein GEF-Faktor von ARF6, als Kooperationspartner von A-RAF bei der ARF6-Aktivierung fungiert. Endocytose und das schnelle Recycling von synaptischen Vesikeln ist von besonderer Bedeutung für die Funktion von Neuronen. Aus dem Befund, dass A-RAF ein Regulator des endocytotischen Recyclings ist ergibt sich dacher eine neue Perspektieve für die Untersuchung der A-RAF Funktion im Nervensystem.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:3751 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Nekhoroshkova, Elena |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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