Os vasos sanguíneos são formados, entre outros componentes, por células endoteliais as quais fazem parte da microvasculatura óssea e são capazes de regular o desenvolvimento ósseo tendo em vista de que os processos de osteogênese e angiogênese estão interligados. Os leucotrienos (LTs) são mediadores lipídicos envolvidos no recrutamento de leucócitos e na regulação da síntese de citocinas. O tratamento com o leucotrieno B4 (LTB4) induz a angiogênese pela superexpressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Assim, o objetivo do trabalho foi investigar o efeito das células endoteliais reguladas pelo LTB4 na diferenciação osteogênica. Para isso, células endoteliais primárias de aorta foram isoladas e cultivadas por até 4 dias e, quando apropriado, foi realizado o tratamento das mesmas com o LTB4. O meio condicionado das células endoteliais foi armazenado para os experimentos com osteoblastos. Células osteoblásticas foram isoladas da calvária e cultivadas por até 21 dias, avaliando-se, portanto, os efeitos das células endoteliais reguladas ou não pelo LTB4 e a resposta dos estímulos exógenos LTB4, o inibidor da síntese de LTs MK 886 e o antagonista do receptor do LTB4, o U75302. Tais respostas foram observadas na fase de crescimento celular, por meio da viabilidade, proliferação e produção de marcadores osteogênicos e angiogênicos como o RANKL, OPG e o VEGF por meio da redução do MTT, citometria de fluxo e western blotting, respectivamente. A diferenciação foi avaliada por meio dos ensaios de fosfatase alcalina (ALP) e expressão gênica por meio de ensaio enzimático e qRT-PCR e mineralização por Vermelho de alizarina. Resultados mostraram que tanto as células endoteliais, mediadas ou não pelo LTB4, quanto os estímulos exógenos não foram capazes de modular a proliferação dos osteoblastos. Porém, durante a diferenciação, o LTB4 inibiu a atividade da ALP, a expressão gênica do BLT1, ALP, BGLAP (osteocalcina) e OPG (osteoprotegerina) foi aumentada, e os genes RANKL e VEGF tiveram a sua expressão diminuída pelo tratamento com o meio condicionado das células endoteliais, mediadas ou não pelo LTB4 (P<0,05). Além disso, a mineralização dos osteoblastos foi aumentada pelas células endoteliais e diminuída pelas células endoteliais mediadas pelo LTB4 (P<0,05). Assim, podemos concluir que os fatores angiogênicos das células endoteliais, mediadas ou não pelo LTB4, exercem um papel importante na regulação da diferenciação osteogênica e formação óssea contribuindo, portanto, para a compreensão de mecanismos que regulam a patofisiologia de doenças ósseas. / Endothelial cells make blood vessels and are involved in the regulation of tissue metabolism. Endothelial cells from bone microvasculature are capable of regulating bone development in view of the fact that the processes of osteogenesis and angiogenesis are interconnected. Leukotrienes (LTs) are lipid mediators involved in leukocyte recruitment and regulation of cytokine synthesis. It is known that the treatment with LTB4 induces angiogenesis by overexpression of vascular endothelial growth factor (VEGF). Thus, the aim of this study was to investigate the effect of LTB4-regulated endothelial cells on osteogenic differentiation. For this, primary endothelial cells from aorta were isolated and cultured for up to 4 days and, where appropriate, the treatment with LTB4 was done. The conditioned medium of these cells was stored for osteoblast experiments. Osteoblastic cells were isolated from calvaria and cultured for up to 21 days, assessing the effects of endothelial cells regulated or not by LTB4 and the response of exogenous LTB4 stimuli, the inhibitor of LTs synthesis MK 886 and the antagonist of LTB4 receptor, U75302. Such responses were observed in the cell growth phase through the viability, proliferation and production of osteogenic and angiogenic markers such as RANKL, OPG and VEGF by MTT assay, flow cytometry and western blotting, respectively. The cell differentiation was evaluated by alkaline phosphatase (ALP), gene expression and mineralization assay through ALP enzymatic assay, qRT-PCR and Alizarin Red staining. Results showed that both endothelial cells, mediated or not by LTB4 and exogenous stimuli were not able to modulate the osteoblasts proliferation. However, during the differentiation, LTB4 inhibited ALP activity, the gene expression of BLT1, ALP, BGLAP (osteocalcin) and OPG (osteoprotegerin) was increased, and the RANKL and VEGF genes had their expression decreased by the treatment with the endothelial cells conditioned medium, mediated or not by LTB4 (P <0.05). In addition, the osteoblasts mineralization was increased by endothelial cells conditioned medium (CM-EC) and decreased by LTB4-mediated endothelial cells conditioned medium (CM-EC-LTB4) (P <0.05). Thus, we can conclude that the angiogenic factors of the endothelial cells, mediated or not by LTB4, play an important role in the regulation of osteogenic differentiation and bone formation, thus contributing to the understanding of mechanisms that regulate the pathophysiology of bone diseases.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14062019-141242 |
| Date | 25 January 2019 |
| Creators | Domezi, João Paulo |
| Contributors | Oliveira, Rodrigo Cardoso de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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