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Previous issue date: 2017-04-05 / CAPES / The advancement of molecular technologies in the scientific field has enabled the
development of various forms of access to the genetic material of organisms in order to
locate, map, isolate, characterize and decode the target genes of a particular individual or a set
of individuals coexisting in a specific environment. Metagenomic studies are very promising
in several areas of biotechnology, such as the discovery of new molecules of industrial
biotechnological interest, the investigation of new antibiotics and drugs, the bioremediation of
environments impacted with toxic metals and the prospection of various enzymes. The
objective of this work was characterize enzymatically a previously screened lipase enzyme
from Metagenomic Library of Terra Preta de Índio. Lipase gene sequence was isolated from
the metagenomic library and expressed in Pichia pastoris under control of PGK promoter.
Recombinant lipase was characterized by hydrolysis activity of lipid substrates and synthesis
ability in organic solvent. In silico analyzes infer the identification of extracellular lipase
belonging to the lipase family, superfamily -hydrolase and lipase activity molecular
function. Enzyme was efficiently produced in P. pastoris and recombinant lipase showed
activity of 374.59 U/mL hydrolyzing p-nitrophenyl palmitate, Vmax (ap.) 143,4 U/mL.min-1,
Km (ap.) 1,4 mM and Kcat (ap.) 103,7 S-1. Enzyme had maximum activity at pH 8.0,
temperature 90 ºC and remained stable at high temperatures. Synthesis ability was evaluated
by the formation of ethyl laurate by esterification reaction of lauric acid with ethanol, yielding
70% conversion in 45 minutes. Recombinant protein is characterized as an alkaline,
thermotolerant, activated by calcium, EDTA e detergents. / O avanço das tecnologias moleculares no campo científico, possibilitou o desenvolvimento de
diversas formas de acesso ao material genético dos organismos, de forma a ser possível
localizar, mapear, isolar, caracterizar e decodificar os genes alvo de um indivíduo particular
ou de um conjunto de indivíduos coexistentes em um ambiente específico. Estudos
metagenômicos são bastante promissores em diversas áreas da biotecnologia, como nas
descobertas de novas moléculas de interesse biotecnológico industrial, na investigação de
novos antibióticos e fármacos, na biorremediação de ambientes impactados com metais
tóxicos e na prospecção de enzimas diversas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar
enzimaticamente uma enzima lipase previamente rastreada de uma Biblioteca Metagenômica
de Terra Preta de Índio. A sequência correspondente ao gene de lipase foi isolada da biblioteca
metagenômica, clonada e expressada em Pichia pastoris sob controle do promotor PGK. A
lipase recombinante foi caracterizada pela atividade de hidrólise de substratos lipídicos e
capacidade de síntese em solvente orgânico. Análises in silico da sequência proteica inferem a
identificação de uma lipase extracelular pertencente à / -
hidrolase e com função molecular para atividade lipásica. A enzima foi produzida
eficientemente em P. pastoris e a lipase recombinante apresentou atividade de 374,59 U/mL
hidrolisando p-nitrofenil palmitato, Vmax(ap.) 143,4 U/mL.min-1, Km(ap.) 1,4 mM e Kcat(ap.)
103,7 S-1. A enzima possuiu atividade máxima em pH 8,0, temperatura 90 ºC e se manteve
estável em altas temperaturas. A capacidade de síntese foi avaliada pela formação de laurato
de etila pela reação de esterificação do ácido láurico com etanol apresentando rendimento de
70% em 45 minutos de reação. A proteína recombinante se caracteriza como uma enzima
alcalina, termotolerante, ativada por cálcio, EDTA e detergentes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/5709 |
| Date | 05 April 2017 |
| Creators | Carmo, Edson Júnior |
| Contributors | Spartaco, Astolfi Filho, Spartaco, Astolfi Filho |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFAM, Brasil, Instituto de Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600, 500, 1984485651082134923 |
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