Die Entwicklung neuer humanmilchähnlicher, funktioneller und bioaktiver Lebensmittel (z. B. Trinkmilch oder Joghurt), die Oligosaccharide mit einer möglichen Gesundheitswirkung enthalten („Health Claim”), sind für die menschliche Ernährung von besonderem Interesse. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Verfahren zu entwickeln, um - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - komplexe Galacto-Oligosaccharide aus Lactose zu synthetisieren und nicht-proteingebundene, komplexe milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufzureinigen und zu charakterisieren.
Zur Identifizierung und Quantifizierung der Oligosaccharide wurden zunächst hochempfindliche Analysenmethoden etabliert (siehe Kapitel 4.1). Da Oligosaccharide Minorkomponenten in der Milch sind, mussten diese von Fetten, Proteinen und Lactose abgetrennt werden. Die Entfettung erfolgte durch Zentrifugation in der Kälte. Die Proteinabtrennung war unter Verwendung einer 10kDa-Ultrafiltrations-Membran optimal (siehe Kapitel 4.1.1.1). Die Abtrennung der Lactose von den Oligosacchariden stellte die größte Herausforderung dar, da beide Stoffklassen zu den Kohlenhydraten gehören und sich nur geringfügig in ihren Molmassen unterscheiden. Des Weiteren liegt Lactose in Kuhmilch im ca. 1000-fachen Überschuss im Vergleich zu den Oligosacchariden vor. Beim Vergleich verschiedener Aufarbeitungsmethoden zur Lactoseabtrennung stellte sich die Festphasenextraktion an Aktivkohle (GCC-SPE) als am besten geeignet heraus. Mit dieser Methode wurde - im Gegensatz zur ebenfalls untersuchten Größenausschlusschromatographie - eine hohe Reproduzierbarkeit der Analyten erreicht. Während bei der Größenausschlusschromatographie das Kuhmilch-Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc nahezu vollständigen verloren ging, konnten nach GCC-SPEAufarbeitung fast 100 % des Analyten wiedergefunden werden (siehe Kapitel 4.1.1.2).
Zur Charakterisierung der Oligosaccharide wurde eine hochauflösende Anionenaustauscherchromatographie mit pulsierender amperometrischen Detektion (HPAEC-PAD) etabliert. Parallel zur hochempfindlichen Detektion mittels PAD wurde zur direkten Strukturaufklärung von underivatisierten Zuckern eine Online-Kopplung an einen Massendetektor (IT-MS) aufgebaut. Einzelne Analyten konnten mit Hilfe von kommerziell erhältlichen Oligosaccharidstandards identifiziert und quantifiziert werden (siehe Kapitel 4.1.1.3). Als weitere Möglichkeit zur Quantifizierung der Oligosaccharide wurden photometrische Schnelltests entwickelt (siehe Kapitel 4.1.2). Zur Absicherung der HPAEC-PAD-Analysendaten sollten zukünftig weitere Analysenmethoden etabliert werden (z. B. enzymatischer Verdau der Oligosaccharide, Analyse der Monosaccharide nach Hydrolyse der OS, HILIC-HPLC).
Die entwickelte HPAEC-PAD-Methode wurde zur Identifizierung und Quantifizierung von Oligosacchariden in Milchproben verschiedener Nutztierarten (siehe Kapitel 4.2.1) und in Produktströmen der milch- und molkeverarbeitenden Industrie (siehe Kapitel 4.2.2) verwendet. Die Untersuchungen von Milchproben unterschiedlicher Nutztierarten zeigten, dass jede Milch hinsichtlich der MOS einzigartig ist. Dies konnte anhand der verschiedenen, identifizierten MOS mit unterschiedlichen Konzentrationen belegt werden. Der höchste MOS-Gehalt konnte in Humanmilch detektiert werden, gefolgt von Kamelmilch, Schafsmilch, Ziegenmilch, Kuhmilch und Stutenmilch (siehe Kapitel 4.2.1). Die Untersuchungen der Produktströme der milch- und molkeverarbeitenden Industrie zeigten, dass es während der Lactosekristallisation und der Aktivkohlebehandlung zu Verlusten an MOS kommt. Bei anderen Prozessschritten, wie Entfettung, Proteinabtrennung, Aufkonzentrierung oder Käseherstellung, war kein Einfluss auf die MOS-Konzentrationen ersichtlich (siehe Kapitel 4.2.2). Die entwickelte Methode zur OS-Bestimmung mittels HPAEC-PAD könnte zukünftig auf die Analysen proteingebundener Oligosaccharide ausgedehnt werden [[Grey, 2009] und [Weiß, 2001]].
Zur Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels wurden Galacto-Oligosaccharide enzymatisch - unter Ausnutzung der Transferaseaktivität von β-Galactosidase - aus Lactose synthetisiert (siehe Kapitel 4.3). Für die Entwicklung des Verfahrens wurden verschiedene β-Galactosidasen (Enzyme aus Kluyveromyces lactis, Aspergillus oryzae und Bacillus circulans) bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen getestet. Die höchste GOS-Ausbeute (19,8 Flächenprozent der HPAEC an Haupt-Trisaccharid, 40,5 % GOS) konnte mit Hilfe der β-Galactosidase aus B. circulans bei pH 4, 40 °C und 12 U/g erreicht werden. Dabei wurden v. a. Tri- bis Pentasaccharide gebildet. Das Hauptreaktionsprodukt war das Trisaccharid 4'-Galactosyllactose (4'-GL). Mit Hilfe der β-Galactosidase aus A. oryzae konnte bei pH 4,5, 40 °C und 12 U/g die zweitgrößte GOS-Ausbeute (14,2 % Haupt-Trisaccharid, 19,7 % GOS) synthetisiert werden. Dabei wurden v. a. Tri- und Tetrasaccharide mit dem Hauptreaktionsprodukt 6'-Galactosyllactose (6'-GL) gebildet. Die geringste GOS-Ausbeute (10,5 % Haupt-Trisaccharid, 3,0 % GOS) wurde mit der β-Galactosidase aus K. lactis bei pH 7, 40 °C und 12 U/g erreicht. Di- und Trisaccharide sowie ein geringer Anteil an Tetrasacchariden konnten dabei synthetisiert werden. Das Hauptreaktionsprodukt war hierbei das Trisaccharid 6'-GL. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die milcheigenen Oligosaccharide während der Lactosehydrolyse mit den drei getesteten β-Galactosidasen weitgehend erhalten bleiben (siehe Kapitel 4.3.4).
Neben den Galacto-Oligosacchariden, die nach enzymatischer Synthese direkt im Lebensmittel eingesetzt werden können, wurden milcheigene Oligosaccharide aus Kuhmilch aufgereinigt (siehe Kapitel 4.4.1). Zur Aufreinigung der MOS wurden Nanofiltrationsversuche in verschiedenen Maßstäben, mit unterschiedlichen Prozessparametern und diversen Membranen durchgeführt. Die im hohen Überschuss vorhandene Lactose wurde vor der Nanofiltration durch enzymatische Hydrolyse in ihre Monosaccharide gespalten, wodurch die Trennung von Monosacchariden und MOS verbessert wurde. Die Membran SR50/SR2 stellte sich für die MOS-Aufreinigung als am besten geeignet heraus. Mono- und Disaccharide konnten mit dieser Membran nahezu vollständig abgetrennt und MOS zu 42,1 % bis 52,4 % wiedergefunden werden. Das Verhältnis der Mono- und Disaccharide zu MOS konnte von ca. 1000:1 auf 18,5:1 zu Gunsten der MOS verändert werden. Der Anteil der Oligosaccharide am Gesamtzuckergehalt wurde von 0,1 % auf 5,1 % erhöht. Aus 40 kg hydrolysiertem Ultrafiltrations-Magermilchpermeat konnten 332,5 mg GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc, 414,1 mg 3'-SL und 91,5 mg 6'-SL gewonnen werden (Kapitel 4.4.1.4). Die durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben sind für den Einsatz in einem potentiell funktionellen Lebensmittel geeignet.
Da der Restlactosegehalt der synthetisierten, GOS-haltigen Proben und der aufgereinigten, MOS-haltigen Proben für weitere Analysen - wie orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung - zu hoch war, erfolgte eine zweite Aufreinigung mittels präparativer Chromatographie an Aktivkohle (siehe Kapitel 4.4.2). Dadurch konnten bei den synthetisierten, GOS-haltigen Proben die Monosaccharide vollständig entfernt, der Restlactosegehalt auf unter 1 % am Gesamtzuckergehalt gesenkt und GOS aufgereinigt werden. Durch die Aktivkohle-Aufreinigung der durch Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben konnten Mono- und Disaccharide von dem milcheigenen Oligosaccharid GalNAc-α-(1→3)-Gal-β-(1→4)-Glc sowie von den GOS - entstanden durch die vorherige Behandlung mit β-Galactosidase - abgetrennt werden. Die Sialyllactosen gingen dabei nahezu vollständig verloren. Auf Grund der vermuteten gesundheitsfördernden Wirkung der Sialyllactosen bedarf es weiterer Forschungsaktivitäten. Insbesondere ist eine Optimierung des Aufgabevolumens, der Konditionierung und der Wahl der stationären Phase wünschenswert.
Mit den durch Aktivkohle aufgereinigten GOS-Lösungen, die weniger als 1 % Mono- und Disaccharide am Gesamtzuckergehalt enthielten, wurden orientierende Studien zur potentiell bifidogenen Wirkung durchgeführt (siehe Kapitel 4.5). Die orientierenden Studien mit Bifidobacterium longum ließen eine potentiell bifidogene Wirkung der untersuchten GOS-Lösungen erkennen. Diese GOS-Proben zeigten dabei eine stärkere bifidogene Wirkung als die bifidogene Referenzsubstanz Lactulose und der Vivinal®GOS-Sirup. Zukünftig sollten die Proben, die nach Beendigung der bakteriellen Reaktion gewonnen wurden, mittels HPAEC-PAD analysiert werden. Dadurch könnte der Kohlenhydratabbau bzw. die Bildung organischer Säuren untersucht werden. Der zeitliche Verlauf sowie der Einsatz anderer Mikroorganismen - wie Lactobazillen und Clostridien - könnten ebenfalls untersucht werden. Andere orientierende Studien, wie antiinflammatorische Tests, wären bei der weiteren Charakterisierung der Oligosaccharide hilfreich.
Die Herstellung eines Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels erfolgte im Labormaßstab unter Zusatz der potentiell bifidogenen GOS-Lösung, die mit Hilfe von β-Galactosidase aus K. lactis synthetisiert wurde. Die Art der Erhitzung des Lebensmittels - Pasteurisierung vs. Hocherhitzung - hatte keinen Einfluss auf die Zuckerzusammensetzung und die Zuckergehalte. Während einer anschließenden sechswöchigen Lagerung in der Kälte konnte kein Abbau der Kohlenhydrate detektiert werden.
Als Ausblick für weitere Forschungen ist die Bestätigung der potentiell bifidogenen Wirkung der MOS-haltigen Proben von primärer Bedeutung. Anschließend könnten Studien mit funktionellen, MOS-haltigen Lebensmitteln durchgeführt werden. Dabei sollte versucht werden, ein humanmilchähnliches Lebensmittel mit ca. 20 % sauren und ca. 80 % neutralen Oligosacchariden herzustellen. Die mittels Nanofiltration aufgereinigten, MOS-haltigen Proben könnten als saurer Zusatz und die enzymatisch synthetisierten, GOS-haltigen Proben als neutraler Zusatz verwendet werden. Des Weiteren sollte eine Überprüfung der potentiell bifidogenen Wirkung sowie eine sensorische Prüfung des hergestellten Lebensmittels durchgeführt werden.
Sobald MOS durch Nanofiltration bzw. GOS mittels enzymatischer Synthese im großtechnischen Maßstab aufgereinigt bzw. hergestellt werden können, sind Humanstudien zur Bestätigung der Wirksamkeit von milcheigenen Oligosaccharide bzw. der Galacto-Oligosaccharide möglich.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten potentiell funktionelle Lebensmittelinhaltsstoffe (enzymatisch synthetisierte, GOS-haltige Lösungen) und Lebensmittelinhaltsstoffe, deren vermutete Funktionalität noch nicht bestätigt wurde (durch Nanofiltration aufgereinigte, MOS-haltige Lösungen), hergestellt werden. Unter Verwendung der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse und der Erfüllung der im Ausblick geschilderten Bedingungen, ist eine großtechnische Produktion eines funktionellen, Oligosaccharid-angereicherten Lebensmittels möglich.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:28443 |
| Date | 01 September 2014 |
| Creators | Zerge, Katja |
| Contributors | Henle, Thomas, Meisel, Hans, Technischen Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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