La maladie de Paget est une ostéopathie caractérisée par une augmentation multifocale du remodelage osseux, qui débute par un front de résorption osseuse, suivi d'une formation osseuse excessive, avec un remodelage anarchique et intense. Les ostéoclastes "OCs" impliqués dans la phase initiale sont les cellules responsables dans l'initiation du processus pagétique. Les OCs pagétiques sont caractérisés par une résistance à l'apoptose, et des anomalies du processus de l'autophagie "en particulier défaut d'induction"; afin de voir si ces deux caractéristiques étaient liées, nous avons émis l'hypothèse d’un rôle des complexes Bcl2-Beclin1. Beclin-1 est une protéine inductrice de l'autophagie qui peut lier les protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2; Bcl-2 inhibe alors Beclin-1 "et donc l'induction de l'autophagie" en conservant ses fonctions anti-apoptotiques. Dans le but d'étudier l'impact de l'expression de Bcl2 sur l’autophagie dans les OCs humains, nous avons utilisé un modèle de différenciation in vitro à partir de monocytes dérivés de sang de cordon ombilical, cultivés en présence de RANKL et MCSF pendant 21 jours. Ces conditions permettent d'obtenir des cellules multinucléées au phénotype ostéoclastique. Pour augmenter l’expression de Bcl-2 dans les OCs et analyser son impact sur l’autophagie par interaction avec Beclin-1, les cultures ont été stimulées par TNFα ou RANKL dans le but d'induire une activation de NF-κB. L'expression de Beclin1 et Bcl2 a été confirmée par immunobuvardage dans les OCs. L’autophagie était induite dans les cultures réalisées en conditions stringentes "milieu pauvre en nutriments", sans variation de l'expression de Bcl2 ou Beclin 1 selon les conditions, et sans impact de TNFa ou RANKL. TNFa stimulait de manière significative l'activation de NF-kB dans les cellules HEK mais pas dans les OCs. Toutefois, et quelque soit les conditions, les immunoprécipitations ne permettaient pas de retrouver d'association entre Beclin1 et Bcl2. En revanche, le partenaire d'interaction classique de Beclin1, PI3K type III, était associé à Beclin1. En conclusion, notre travail n'a pas permis d'étudier la formation des complexes Beclin1/Bcl2 et les relations entre apoptose et autophagie, en partie du fait de la complexité du modèle "effets multiples de NF-kB et TNFa" ce qui n'exclut pas l'hypothèse initiale "à ré-évaluer par une méthodologie plus appropriée". En revanche les différentes techniques d'analyse sont maintenant au point pour la poursuite de l'étude. / Abstract : Paget's disease is an osteopathy characterized by a multifocal increase in bone remodeling, which
begins with excessive bone resorption followed by increased bone formation. Osteoclasts "OCs"
were incriminated in the initiation of the pagetic process. Pagetic OCs are characterized by a
resistance to apoptosis, and abnormalities in the process of autophagy “in particular induction
defect”. In order to define whether these two characteristics were linked, we hypothesized the role
of Bcl2-Beclin1 complexes. Beclin-1 is an autophagy-inducing protein that can bind anti-apoptotic
proteins of the Bcl-2 family; Bcl-2 then inhibits Beclin-1 "and thus the induction of autophagy"
while retaining its anti-apoptotic functions. To study the impact of Bcl2 expression on autophagy in
human OCs, we used an in vitro differentiation model that uses monocytes, which are derived from
umbilical cord blood and grown in the presence of RANKL and MCSF for 21 days. These
conditions make it possible to obtain multinucleated cells with an osteoclastic phenotype. To
increase the expression of Bcl-2 in OCs and analyze its impact on autophagy due to its interaction
with Beclin-1, cultures were stimulated with TNFα or RANKL in order to induce NF-κB activation.
The expression of Beclin1 and Bcl2 was confirmed by immunoblotting of Ocs cell lysates.
Autophagy was induced in cultures carried out under stringent conditions "nutriment-deprived
mediun", but we did not observe any variation in the expression of Bcl2 or Beclin 1 according to
the culture conditions or TNFα or RANKL stimulation. TNFα significantly stimulated the
activation of NF-κB in HEK cells but not in OCs. However, whatever the conditions, results from
immunoprecipitaion experiments did not reveal any association between Beclin1 and Bcl2. On the
other hand, the classic interaction partner of Beclin1, PI3K type III, was associated with Beclin1. In
conclusion, our work did not allow us to demonstrate the formation of Beclin1 / Bcl2 complexes
and the relationship between apoptosis and autophagy, partly because of the complexity of the
model "multiple effects of NF-κB and TNFα". Our initial hypothesis should thereby be re-evaluated
using a more appropriate methodology. On the other hand, the different techniques are now ready
for further study.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usherbrooke.ca/oai:savoirs.usherbrooke.ca:11143/11869 |
| Date | January 2017 |
| Creators | Nazari, Shekeba |
| Contributors | Roux, Sophie |
| Publisher | Université de Sherbrooke |
| Source Sets | Université de Sherbrooke |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Mémoire |
| Rights | © Shekeba Nazari, Attribution - Pas d’Utilisation Commerciale - Pas de Modification 2.5 Canada, Attribution - Pas d’Utilisation Commerciale - Pas de Modification 2.5 Canada, Attribution - Pas d’Utilisation Commerciale - Pas de Modification 2.5 Canada, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.5/ca/ |
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