Schistosomiasis is one of the most socioeconomically important parasitic diseases, affecting over 200 million people worldwide. Praziquantel is the only drug treatment available in most parts of the world and there is an urgent need to find a viable alternative to this drug. Acetylcholine-gated ion channels of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) family have been shown to be effective drug targets for treatment of various helminth infections. Here, we describe a first investigation of putative nAChR subunits of the model parasite, Schistosoma mansoni. Four predicted subunits, smp_031680, smp_180570, smp_139330, and smp_012000, were cloned from S. mansoni by a combination of RT-PCR and RACE (rapid amplification of cDNA ends) procedures. All four full-length proteins contain prerequisite features of cation-selective nAChRs. Subsequent functional studies by RNA interference (RNAi) in parasite larvae (schistosomulae) and adult worms showed that the four nAChR subunits play an important role in the control of motor activity. RNAi targeting smp_031680 and smp_180570 caused hypoactivity, whereas knockdown of smp_139330 and smp_012000 caused hyperactivity, suggesting these subunits form channels that either stimulate or inhibit movement. Further confocal immunofluorescence studies of smp_031680 and smp_139330 showed that nAChRs are expressed extensively in both central and peripheral nervous systems of the parasite, musculature (smp_139330 only) and female reproductive system. Importantly, we observed distinct expression patterns of smp_031680 and smp_139330, which suggests that they are not part of the same channel. Our repeated efforts to heterologously express the four putative subunits in Xenopus oocytes were unsuccessful. We were unable to obtain functional channels from subunits expressed individually or in combination, in the presence and absence of S. mansoni orthologues of Caenorhabditis elegans ancillary proteins ric-3 and unc-50, which are known to improve heterologous expression of nAChRs. As an alternative strategy, we modified the subunits by inserting a fluorescent tag, sub-cloned the modified sequences into a mammalian expression vector, and tested for protein expression in transfected HEK293 cells by fluorescence microscopy. The results show that nAChRs can be expressed in the mammalian cells but additional experiments are needed to test for channel activity. All in all, this is a small yet significant first step in elucidating the parasite's cholinergic nervous system and identifying some of the receptors involved in cholinergic motor control in S. mansoni. / La schistosomiase est une des maladies parasitaires les plus importantes sur le plan socioéconomique, affectant plus de 200 millions de personnes à travers le monde. Le praziquantel est le seul médicament disponible pour le traitement de la schistosomiase dans la plupart des régions du monde et il est urgent de trouver un traitement de rechange viable pour complémenter ce médicament. Il a été démontré que les canaux ioniques de type pentamériques sensibles à de l'acétylcholine appartenant à la famille des récepteurs nicotiniques (nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) sont la cibles de plusieurs médicaments vermifuges utilisés pour le traitement de diverses infections causées par des helminthes. Dans ce mémoire, nous décrivons pour la première fois l'existence de sous-unités nAChR putatives chez le parasite modèle Schistosoma mansoni. Les séquences codantes complètes de quatre sous-unités putatives, smp_031680, smp_180570, smp_139330, et smp_012000, ont été déterminées et clonées chez S. mansoni en utilisant une combinaison de RT-PCR (transcription inverse et réaction en chaîne par la polymérase) et de RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc). Les quatre séquences protéiques obtenues possèdent les caractéristiques typiques des nAChRs perméables aux cations. Nous démontrons également grâce à des études fonctionnelles d'interférence de l'ARN (RNAi) réalisées dans des larves de parasites (schistosomules) et des vers adultes que les quatre sous-unités nAChR jouent un rôle important dans le contrôle de l'activité motrice. En effet, nous avons observé que l'RNAi ciblant smp_031680 et smp_180570 causait l'hypoactivité motrice, tandis que la diminution de l'expression génique de smp_139330 et smp_012000 causait l'hyperactivité motrice, suggérant par conséquent que ces sous-unités forment des canaux ioniques capable de stimuler ou d'inhiber l'activité motrice. Par ailleurs, des études d'immunolocalisation et de microscopie confocale ont montré que les sous-unités nAChRs smp_031680 et smp_139330 sont abondamment exprimées dans les systèmes nerveux central et périphérique du parasite, ainsi qu'au niveau de la musculature (smp_139330 seulement) et du système reproducteur féminin. Il est important de noter nous avons observé des profils d'expression distincts entre smp_031680 et smp_139330, ce qui suggère que ces sous-unités ne font pas partie du même récepteurs. Nos tentatives répétées pour exprimer de manière hétérologue ces quatre sous-unités putatives dans des ovocytes de Xenopus ont été infructueuses. Nous n'avons pas pu obtenir de récepteurs fonctionnels à partir de sous-unités exprimées individuellement ou en combinaison, en présence et en l'absence de protéines auxiliaires de S. mansoni orthologues aux protéines ric-3 et unc-50 de Caenorhabditis elegans, lesquelles sont connus pour améliorer l'expression hétérologue des nAChRs. Alternativement, nous avons modifié les sous-unités en y insérant un marqueur fluorescent et avons sous-cloné ces séquences dans un vecteur d'expression de mammifère. Nous avons ensuite visualisé par immunofluorescence l'expression des protéines d'intérêts transfectées dans des cellules HEK293. Les résultats montrent que les nAChRs sont exprimés dans les cellules de mammifères, mais d'autres expériences sont nécessaires afin de tester l'activité de ces récepteurs. Somme toute, bien que limités, nos résultats constituent un premier pas important dans la compréhension du système nerveux cholinergique du parasite et ont permis d'identifier quelques-uns des récepteurs impliqués dans le contrôle cholinergique des fonctions motrices chez S. mansoni.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.123079 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Rashid, Mohammed |
| Contributors | A Paula Ribeiro (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Institute of Parasitology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically submitted theses |
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