Orientador : Prof. Dr. David Alexander Mitchell / Coorientador : Profª. Drª. Nadia Krieger / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 18/11/2015 / Inclui referências: f. 38-44;63-68;112-114;120-126 / Resumo: Biorrefinaria é um novo conceito que abrange as instalações industriais que utilizam a biomassa como matéria-prima para a produção de intermediários químicos, combustíveis e energia, analogamente às refinarias de petróleo. Uma matéria prima que apresenta oportunidades para ser utilizada no Brasil é a polpa cítrica, que é o resíduo do processamento do suco de laranja. Este resíduo é produzido em grandes quantidades no Brasil, que é o maior produtor mundial de sucos. Atualmente, a polpa cítrica não tem valor comercial importante, já que os custos de secagem comprometem as margens de revenda como ração animal, que é a destinação típica para este resíduo. Por outro lado, a polpa cítrica é uma fonte de limoneno e pectina, que já têm processos de extração estabelecidos, e os carboidratos da polpa podem ser transformadas em etanol e alguns ácidos com alto valor agregado, como o ácido D-galacturônico, o ácido L-galactônico, o ácido múcico e o ácido ascórbico. O objetivo geral desta tese de doutorado foi propor soluções para três problemas das biorrefinarias de polpa cítrica, a falta de conhecimento sobre a hidrólise enzimática da pectina, o custo alto das pectinases que são usadas na hidrólise enzimática da pectina e a incapacidade de Saccharomyces cerevisiae produzir etanol a partir do ácido galacturônico liberado. Na primeira parte do trabalho, a hidrólise enzimática da pectina foi caracterizada, com intuito de entender a lentidão na liberação dos açúcares. Ficou demonstrado, pela primeira vez, que existe uma desaceleração significativa na liberação de açúcares redutores já nos primeiros minutos de hidrólise de pectina por complexos pectinolíticos. Foi mostrado que, com esta falta de linearidade no início da reação, o tempo de incubação escolhido para um ensaio tem grande efeito na atividade medida. De fato, é destacada a necessidade de estabelecer um protocolo padrão para a determinação da atividade pectinolítica, em termos da temperatura, da concentração de pectina e do tempo de incubação. Somente com esta padronização vai ser possível comparar processos de produção de pectinases realizados por grupos diferentes. Na segunda parte do trabalho, foi desenvolvido um processo, em escala piloto, para a produção de pectinases em fermentação em estado sólido, com intuito de baixar o custo destas enzimas. O processo foi realizado com 15 Kg (base seca) de um substrato composto por polpa cítrica e bagaço de cana, na razão de 51,6 a 48,4, (m/m). O uso de uma proporção alta de bagaço propiciou um leito de alta porosidade e, desta maneira, o problema de superaquecimento do leito, que é comum em processos de fermentação em estado sólido, foi completamente evitado. Também foi demonstrado que, no final da fermentação, o sólido pode ser secado e adicionado diretamente a uma solução de pectina para efetuar sua hidrólise; desta maneira, os custos de recuperação e concentração das pectinases são evitados. Na terceira parte do trabalho, foi construída uma linhagem de S. cerevisiae capaz de consumir o ácido D-galacturônico. Isto foi conseguido pela integração de uma via heteróloga, proveniente de fungos filamentosos, de catabolismo de ácido D-galacturônico. Este estudo representa o primeiro passo na construção de uma cepa de S. cerevisiae capaz de produzir etanol a partir de ácido D-galacturônico, sendo que este açúcar chega a compor cerca de 18% do total de açúcares em hidrolisados de polpa cítrica. Palavras-chave: Biorrefinarias, polpa cítrica, ácido D-galacturônico, etanol, pectinases, escalonamento, fermentação no estado sólido. / Abstract: Biorefineries are industrial installations that utilize biomass as a raw material for the production of chemicals, fuels and energy, in a manner analogous to petroleum refineries. One raw material that has the potential to be utilized in Brazil is citrus pulp, the residue of the processing of orange juice. This residue is produced in large quantities in Brazil, which is the world's largest producer of orange juice. Currently, citrus pulp has no significant commercial value; it is typically used as a supplement for cattle feed, but the drying costs mean that the return is minimal. However, citrus pulp is a source of limonene and pectin, for which extraction processes are already established. Further, the carbohydrates in the pulp can be processed into ethanol and some acids with high added value, such as D-galacturonic acid, L-galactonic acid, mucic acid and ascorbic acid. The overall objective of this thesis was to propose solutions to three problems faced by citrus pulp biorefineries: the lack of knowledge about enzymatic hydrolysis, the high cost of the pectinases that are used in the enzymatic hydrolysis of pectin and the inability of Saccharomyces cerevisiae to produce ethanol from the galacturonic acid released in such hydrolysis processes. In the first part of the work, the enzymatic hydrolysis of pectin was characterized, with the aim of understanding why the release of sugars is so slow. For the first time, it was demonstrated that there is a significant deceleration in the release of reducing sugars within the first minutes of pectin hydrolysis by pectinases. It was shown that, with this lack of linearity at the start of the reaction, the incubation time that is chosen for an assay of pectinase activity has a large effect on the activity that is measured. In fact, the thesis raises the need to establish a standard protocol for the determination of pectinolytic activity, in terms of temperature, pectin concentration and time of incubation. Only with such standardization will it be possible to compare pectinase production processes proposed by different research groups. In the second part of the work, a pilot-scale process was developed for the production of pectinases in solid-state fermentation, with the aim of lowering the cost of these enzymes. The process was conducted with 15 kg (dry basis) of a substrate composed of citrus pulp and sugarcane bagasse, in a ratio of 51.6 to 48.4 (by mass). The use of a high proportion of bagasse ensured the bed had a high porosity and, consequently, the problem of overheating of the bed, which is common in solid-state fermentation processes, was completely avoided. It was also shown that, at the end of the fermentation, the solid can be dried and added directly to a pectin solution to effect its hydrolysis; thereby avoiding the need to recover and concentrate the pectinases. In the third part of the work, a strain of S. cerevisiae was constructed that is capable of consuming D-galacturonic acid. This was achieved by integration of a heterologous pathway for the catabolism of D-galacturonic acid from filamentous fungi. This study represents the first step in the construction of a strain of S. cerevisiae capable of producing ethanol from D-galacturonic acid, which represents about 18% of the total sugars in citrus pulp hydrolysates. Keywords: Biorefineries, citrus pulp, D-galacturonic acid, ethanol, pectinases, scale-up, solid-state fermentation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:dspace.c3sl.ufpr.br:1884/45450 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Biz, Alessandra |
| Contributors | Krieger, Nadia, 1952-, Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica), Mitchell, David Alexander |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 126 f. : il., grafs., tabs., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPR, instname:Universidade Federal do Paraná, instacron:UFPR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | Disponível em formato digital |
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