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Previous issue date: 2001-03-20 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A seqüência completa de nucleotídeos do gene pepg1 foi determinada. A análise desta seqüência mostrou que este gene apresenta dois possíveis introns de 58 pares de bases, um potencial cis elemento TATA na posição -151 e um potencial CAAT Box na posição -273. A região codificadora contém 1110 pb, após a retirada dos introns, e a partir dessa seqüência foi deduzida uma proteína com 370 aminoácidos. A seqüência de aminoácidos apresenta grande homologia com poligalacturonases de outros fungos filamentosos, com massa molecular deduzida de 38,4 KDa e ponto isoelétrico teórico de 8,31. Quatro fagos recombinantes foram isolados a partir do banco genômico de Pencillium expansum, utilizando-se como sonda um fragmento de DNA de 1,6 Kb contendo o gene pgg1 de P. griseoroseum, os quais foram denominados λPEPG1, λPEPG2, λPEPG3 e λPEPG4. Os fagos λPEPG3 e λPEPG4 apresentaram fragmentos genômicos clonados de 14,5 e 16,6 Kb. Fragmentos de DNA de Bam HI de 3,6 e 5,1 Kb dos fagos λPEPG3 e λPEPG4 respectivamente, que hibridizaram com a sonda, foram subclonados no vetor pBluescript® SK+, originando os plasmídeos recombinantes pEPG3 e pEPG4. O gene pepg1 foi usado na transformação de protoplastos do mutante nia/pab/faw de P. expansum na presença de polietilenoglicol e CaCl2. Para a seleção dos transformantes, em meio mínimo contendo nitrato de sódio como fonte de nitrogênio, foi usado o gene nia de Fusarium oxysporum. Cento e cinqüenta e cinco, dentre os 234 transformantes obtidos, foram considerados estáveis quanto ao gene de nitrato redutase, e foram analisados quanto à produção de pectinase total em meio mineral sólido tamponado contendo pectina. Foram observadas linhagens transformantes apresentando halos de degradação da pectina maiores e menores que os da linhagem selvagem e mutante, mas a maioria dos transformantes apresentou resultado similar ao dessas linhagens. Cinqüenta e três transformantes foram caracterizados quanto à produção de poligalacturonase. Foram observados transformantes com atividade de PG inferior à da linhagem selvagem, mas a maioria dos transformantes analisados apresentou aumento na atividade dessa enzima, variando de 10 a 89 % em relação à linhagem selvagem. A hibridização do DNA total dessas linhagens, clivado com enzimas de restrição, revelou a ocorrência de integração heteróloga e de múltiplas cópias em tandem do gene pepg1 no genoma de P. expansum. / The nucleotide sequence of a polygalacturonase encoding gene (pepg1) from Penicillium expansum was determined. Putative TATA and CAAT motifs were seen at position -151 and -273, respectively, from the translation start site. The pepg1 gene encodes a predicted protein of 370 aas after splicing of two introns of 58 bp. The estimated molecular mass of the polypeptide is 38.4 KDa with pI of 8.31. Multiple sequence alignment of PG protein sequences revealed high homology between PEPG1 and PG from several filamentous fungi. In order to isolate other PG genes a genomic bank from Penicillium expansum was reprobed with a 1.6 Kb DNA fragment which corresponds to a PG gene from P. griseoroseum. Four recombinant phages were isolated and designated λPEPG1, λPEPG2, λPEPG3 and λPEPG4. DNA fragments of 3.6 Kb and 5.1 Kb from phages λPEPG3 and λPEPG4, respectively, were subcloned into pBluescript® SK+ vector. These plasmids were named pEPG3 and pEPG4. Protoplasts of the mutant strain nia/pab/faw of P. expansum were transformed with the pepg1 gene in the presence of polyethylene glycol and CaCl2 . Transformants were selected in minimal medium containing sodium nitrate as nitrogen source, using the nia gene of Fusarium oxysporum. One hundred and fifty-five transformants among 234, stably maintained the nia gene and were screened for PG overproduction by a plate assay on minimal medium containing pectin. Most transformants showed halo size similar to the mutant and wild-type strains, although smaller and larger halos were also detected. The PG production of fifty-five transformants was analyzed and some transformants had lower PG activity when compared to the wild-type strain. However, most transformants produced significantly more PG than the wild type. Southern analysis of the transformed strains detected heterologous and tandem integration of multiple copies of the pepg1 gene.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/10919 |
| Date | 20 March 2001 |
| Creators | Ribeiro, João Batista |
| Contributors | Queiroz, Marisa Vieira de, Coelho, Jorge Luiz Cavalcante, Araújo, Elza Fernandes de |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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