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Previous issue date: 2011-08-26 / Universidade Federal de Minas Gerais / The thioredoxin peroxidase (Tpx) is a group of antioxidant proteins that has been widely studied due to its role in the decomposition of different peroxides such as H2O2, peroxynitrite and organic peroxides. The ability of peroxide decomposition by Tpx is related to the presence of a conserved cysteine called peroxidatic cysteine (CysP). Most Tpx has a second cysteine (resolving cysteine - CysR) which forms a disulfide with CysP after peroxide decomposition. In addition to the peroxidase activity, some Tpx have molecular chaperone activity and are also involved in signaling of cell growth induced by hydroperoxides. It has been demonstrated that the Tpx cytosolic isoform of Schizosaccharomyces pombe is able to interact directly with MAPK (Sty1) via mixed disulfide, which is stabilized when the CysR is replaced by a serine residue. Saccharomyces cerevisiae have a nuclear isoform of Tpx (nTPx) and review of the literature shows the importance of this protein in maintaining the telomere silencing and decomposition of organic peroxides in the nucleus. Scale proteomic studies using mass spectrometry and two-hybrid indicate the nTPx association with MAP kinases. However, despite its location and participation in biological processes of relevance, works related to nTPx are scarce. Scale proteomics studies reported the physical interaction between nTPx and Mec3, Gts1, Pc1 and Dog2. These proteins are related to cell signaling or maintenance of telomeric silencing. However, no specific studies were performed to confirm these interactions and if they are established by mixed disulfides. This study aimed to evaluate the interactions previously described in the literature between nTPx and Mec3, Pcl1, Dog2 and Gts1 through the expression and purification of these proteins and in vitro evaluation of interactions as well as in vivo tests using two-hybrid. Several efforts were made with different approaches, nevertheless it was impossible overexpression of Mec3, Pcl1, Dog2, indicating a toxic effect of these proteins on the strains used. Furthermore, we found great success in overexpression of nTPx and nTpxC112S (8 mg and 10 mg per liter of cell culture) in Eschericchia coli strain BL21 (DE3) C43. This is the first time that these proteins were expressed in native form. It was also possible to overexpress the Gts1 protein in the same strain. These results could lead for new approaches in future studies in order to determine these threedimensional structures, by methods such as X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance (NMR). Finally, the results obtainedusing the technique of two-hybrid yeast confirmed the interaction in vivo among nTPx and Mec3, Gts1, Dog2. However, opposing the results described in the literature, no interaction was detected between nTPx and PCL1, emphasizing the necessity of specific experiments in addition to the large-scale ones. / As tiorredoxinas peroxidases (TPx), constituem um grupo de proteínas antioxidantes que vêm sendo bastante estudadas pela sua atuação na decomposição de diversos tipos peróxidos, como o H2O2, peroxinitritos e peróxidos orgânicos. A capacidade de decomposição de peróxidos pelas TPx está relacionada a presença de uma cisteína conservada denominada de cisteína peroxidásica (CysP). A maioria das TPx possuem uma segunda cisteína (cisteína de resolução - CysR) a qual forma um dissulfeto com CysP após a decomposição de um peróxido. Adicionalmente, à atividade peroxidásica, algumas TPx possuem atividade de chaperona molecular e também estão envolvidas em processos de sinalização de crescimento celular induzidos por hidroperóxidos. Já foi demonstrado que a isoforma citosólica de TPx de Schizosaccharomyces pombe é capaz de interagir diretamente com uma MAPK (Sty1) através da formação de um dissulfeto misto entre as proteínas, que é estabilizado quando a CysR é substituída por um resíduo de serina. Entretanto, nenhuma interação deste tipo foi descrita para outros organismos. Em Saccharomyces cerevisiae ocorre uma isoforma de TPx no núcleo (nTPx) e a revisão da literatura demonstra a relevância desta proteína na manutenção do silenciamento dos telômeros e decomposição de peróxidos orgânicos no núcleo. Estudos em escala proteômica utilizando espectrometria de massa e duplo híbrido indicam a associação de nTPx com MAP quinases, entretanto, apesar de sua localização e participação em processos biológicos de relevância, trabalhos relacionados com nTPx são escassos. Estudos em escala proteômica relataram a interação física entre nTPx e as proteínas Mec3, Gts1, Pcl1 e Dog2 relacionadas a sinalização celular ou manutenção do silenciamento telomérico. No entanto, não foram efetuados estudos pontuais visando confirmar estas interações como também averiguar a possibilidade das interações entre nTPx e as proteínas supracitadas serem estabelecidas através de dissulfetos mistos. Este trabalho teve por objetivo a avaliação de interações previamente descritas na literatura entre nTPx e Mec3, Pcl1 e Dog2 por meio da expressão e purificação destas proteínas e avaliação in vitro de interações como também in vivo através de ensaios de duplo híbrido. Diversos esforços com diferentes abordagens foram efetuados, entretanto não foi possível a superexpressão de Mec3, Pcl1, Dog2, indicando um efeito tóxico destas proteínas sobre as linhagens utilizadas. Por outro lado, obtivemos grande sucesso na superexpressão de nTPx e nTpxC112S (8 mg e 10 mg por litro de cultura de células) em linhagens de Eschericchia coli BL21 (DE3) C43, o que representa a primeira vez que estas proteínas foram expressas sem trucamentos. Também foi possível expressar na mesma linhagem a proteína Gts1. Estes resultados abrem a possibilidade de estudos posteriores visando a determinação de suas estruturas tridimensionais, por metodologias como cristalografia de raios-X ou ressonância magnética nuclear (RMN). Por fim, os resultados de interação in vivo utilizando a técnica de duplo híbrido em levedura, confirmaram a interação entre nTPx e Mec3, Gts1 e Dog2. Entretanto ao contrario dos resultados descritos na literatura, não foi detectada interação entre nTPx e Pcl1, reforçando que experimentos pontuais são necessários em adição aos experimentos de larga escala.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/7008 |
| Date | 26 August 2011 |
| Creators | Breyer, Carlos Alexandre |
| Contributors | Oliveira, Marcos Antonio de |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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