Les techniques optogénétiques ont laissé entrevoir un potentiel exceptionnel dans l’étude des mécanismes gouvernant l’intégration de l’information dans le système nerveux. Afin d’établir les relations existant entre des séquences d’activité neuronale définies et le comportement, les techniques optiques doivent permettre d’appréhender des groupes de neurones avec une résolution cellulaire chez l’animal éveillé et mobile. Jusqu’alors, l’activité neuronale chez l’animal vigile non contraint n’a été contrôlée que via l’illumination en champs large. Dans ce travail, nous démontrons une résolution proche de la cellule unique pour la photoactivation, chez l’animal éveillé et mobile, à l’aide d’un fibroscope. Les motifs de photoactivation, produits par holographie, sont transmis jusqu’à la souris par un guide d’image couplé à un micro-objectif. Une imagerie de fluorescence permet de localiser les cellules d’intérêt et d’enregistrer l’activité neuronale, par épifluorescence, illumination structurée, ou encore microscopie confocale multi-point sans balayage. Le fibroscope est testé chez l’animal anesthésié et chez l’animal éveillé et mobile, dont les interneurones de la couche moléculaire du cervelet expriment les protéines ChR2-tdTomato et GCaMP. Nous avons généré des signaux calciques somatiques en ciblant les corps cellulaires avec des spots de photoactivation de 5µm de diamètre. Chez l’animal anesthésié, nous avons démontré que la photoactivation pouvait être réalisée avec une résolution latérale de 10µm et une résolution axiale de 40µm, en considérant la demi-largeur à mi-hauteur de la courbe de résolution. Nous avons montré qu’un ou plusieurs soma pouvaient être ciblés sélectivement. Chez l’animal éveillé et mobile, le champs de vue est resté stable au cours des acquisitions. Nous avons trouvé une résolution latérale pour la photoactivation égale à 10µm, démontrant une résolution de photoactivation proche de la cellule unique chez l’animal vigile non contraint. / Optogenetics has shown great potential to study the mechanisms governing information integration in the brain. To link specific spatiotemporal activity patterns and behaviours, optical methods should provide simultaneous access to a group of neurons with single cell resolution in freely behaving animals. So far, however, optogenetic control of neural activity in freely behaving rodents has been performed with widefield illumination only. Here, we demonstrate photoactivation with near-cellular resolution in freely behaving mice using a fiberscope. Photoactivation patterns, produced with computer-generated holography, were transmitted to the mouse using a fiber bundle coupled to a micro-objective. Fluorescence imaging allowed locating cells and recording neuronal activity, via either epifluorescence, structured illumination, or scanless multi-point confocal microscopy. The fiberscope was tested both in anesthetized and freely-behaving mice co-expressing ChR2-tdTomato and GCaMP proteins in cerebellar molecular layer interneurons. By targeting an interneuron soma with a 5µm diameter photoactivation spot, we could elicit a calcium transient. In anesthetized animals, we demonstrated that photoactivation could be performed with 10µm and 40µm lateral and axial resolution, half-width at half maximum, respectively. We showed that either a single or multiple somata could be selectively targeted. In awake unrestrained animals, the field of view remained stable during our acquisitions. We found that photoactivation lateral resolution remained equal to 10µm, demonstrating photoactivation with near-cellular resolution in freely behaving mice.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2013PA05T089 |
| Date | 19 December 2013 |
| Creators | Szabo, Vivien |
| Contributors | Paris 5, Emiliani, Valentina |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
Page generated in 0.003 seconds