Die vorliegende Arbeit wurde im Zeitraum von Oktober 2002 bis November 2005
an dem Institut für Biochemie und Biologie der Universität Potsdam in Kooperation
mit dem Institut für Chemie des GKSS Forschungszentrums in Teltow
unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. B. Micheel und Herrn Prof. Dr. Th.
Groth angefertigt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen von Immunzellen mit
verschiedenen Kultursubstraten untersucht. Dafür wurden drei verschiedene Hybridomzelllinien
eingesetzt. Eine Hybridomzelllinie (K2) ist im Laufe dieser Arbeit
hergestellt und etabliert worden.
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Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten Kulturoberflächen führte
bei Hybridomzellen zu einer deutlich gesteigerten Antikörpersynthese im Vergleich
zu herkömmlichen Zellkulturmaterialien. Obwohl diese Zellen in der Regel
als Suspensionszellen kultiviert werden, führten die eingesetzten Polymermembranen
(PAN, NVP) zu einer verbesserten Antikörpersynthese (um 30%)
gegenüber Polystyrol als Referenz. Es konnte gezeigt werden, dass es einen Zusammenhang
zwischen der Produktivität und dem Adh asionsverhalten der Hybridomzellen
gibt.
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Um den Einfluss von Proteinen der extrazellulären Matrix auf Zellwachstum
und Antikörpersynthese von Hybridomzellen zu untersuchen, wurden proteinbeschichtete
Polystyrol-Oberflächen eingesetzt. Für die Modifikationen wurden
Fibronektin, Kollagen I, Laminin und BSA ausgewählt. Die Modifikation der
Polystyrol-Oberfläche mit geringen Mengen Fibronektin (0,2-0,4 µg/ml) führte
zu einer beträchtlichen Steigerung der Antikörpersynthese um 70-120%. Für
Kollagen I- und BSA-Beschichtungen konnten Steigerungen von 40% beobachtet
werden. Modifikationen der Polystyrol-Oberfläche mit Laminin zeigten nur
marginale Effekte. Durch weitere Versuche wurde bestätigt, dass die Adhäsion
der Zellen an Kollagen I- und Laminin-beschichteten Oberflächen verringert
ist. Die alpha2-Kette des alpha2beta1-Integrins konnte auf der Zelloberfläche nicht nachgewiesen
werden. Durch ihr Fehlen wird wahrscheinlich die Bindungsfähigkeit
der Zellen an Kollagen I und Laminin beeinflusst. Durch die Ergebnisse konnte
gezeigt werden, dass Hybridomzellen nicht nur Suspensionszellen sind und
das Kultursubstrate das Zellwachstum und die Produktivität dieser Zellen stark
beeinflussen können. Der Einsatz von synthetischen und proteinbeschichteten
Kultursubstraten zur Steigerung der Antikörpersynthese kann damit für die industrielle
Anwendung von großer Relevanz sein.
Für die Modellierung einer Lymphknotenmatrix wurden Fibronektin, Kollagen I,
Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose in verschiedenen Kombinationen
an Glasoberflächen adsorbiert und für Versuche zur In-vitro-Immunisierung
eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Modifikation der Oberflächen die
Aktivierung und Interaktion von dendritischen Zellen, T- und B-Lymphozyten
begünstigt, was durch den Nachweis spezifischer Interleukine (IL12, IL6) und
durch die Synthese spezifischer Antikörper bestätigt wurde. Eine spezifische
Immunreaktion gegen das Antigen Ovalbumin konnte mit den eingesetzten Zellpopulationen
aus Ovalbumin-T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen nachgewiesen
werden. Die In-vitro-Immunantwort wurde dabei am stärksten durch eine Kombination
von Kollagen I, Heparansulfat und N-Acetylglucosamin-mannose auf
einer Glasoberfläche gefördert.
Die Etablierung einer künstlichen Immunreaktion kann eine gesteuerte Aktivierung
bzw. Inaktivierung von körpereigenen dendritischen Zellen gegen bestehende
Krankheitsmerkmale in vitro ermöglichen. Durch die Versuche wurden
Grundlagen für spezifische Immunantworten erarbeitet, die u.a. für die Herstellung
von humanen Antikörpern eingesetzt werden können. / In this scientific work the interactions of immune cells with different culture substrata were investigated. Therefore, three hybridoma cell lines were tested, one cell line (K2) was established during this work. The application of synthetic and protein-coated culture surfaces lead to a significantly increased synthesis of monoclonal antibodies in comparison to usual tissue polystyrene. Although hybridoma cells were normally cultured in suspension applied polymer membranes like PAN and NVP induced an increase by 30%. Furthermore, an influence of cell adhesion and antibody synthesis could be shown.
To investigate the influence of extracellular matrix proteins on growth and antibody synthesis of hybridoma cells tissue culture polystyrene was coated with fibronectin, collagen I, laminin and bovine serum albumine in different concentrations. Modifications with fibronectin (concentrations between 0.2 and 0.4 µg/ml) improved the yield of monoclonal antibodies considerably by 70-120%. Coating cell culture plates with collagen I and bovine serum albumine induced an increase by 40%. The coating with laminin showed only marginal effects. Further experiments approved a decreased adhesion of hybridoma cells on collagen I and laminin coated surfaces. FACS analysis showed a reduced presence of the alpha2-chain of the alpha2/beta1-integrin responsible for mediating the binding to collagen I and laminin. Probably, the binding affinity to collagen I and laminin coated surfaces was influenced by this. The results showed a high impact of modified culture substrata on antibody synthesis even if hybridoma cells were cultured in suspension normally and this could be an approach for industrial application. The second part of this work comprised the creation of a lymph node paracortex related surface. Different matrix proteins like fibronectin, collagen I, heparane sulfate and a sugar named N-acetylglucosamine-mannose were coated in different combinations on glass surfaces to create a matrix. Dendritic cells were cultivated on these surfaces and get activated with ovalbumin. After that naïve T- and B-cell populations were added and it could be shown nicely that the modifications of the culture surface were essential for activation and interaction of dendritic cells, T- and B-cells which resulted in the secretion of specific interleukins (IL12, IL6) and specific antibodies (anti-ovalbumin-antibodies). In these experiments a specific immune respone to ovalbumin in vitro could be detected if the cells were isolated from ovalbumin-receptor-transgenic-mice (TgNDO11.10). This In-vitro-immunization was triggered at most if cells were cultured on a surface coated with a combination of collagen I, heparane sulfate and N-acetylglucosamine-mannose. These experiments could be basics for controlled specific immune reactions in vitro which could be used for the production of human antibodies or for the controlled activation or inactivation of immune cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:884 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Heilmann, Katja |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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