Listeria monocytogenes est une bactérie à Gram+, ubiquiste, pathogène intracellulaire d’origine alimentaire, responsable chez l’homme, de nombreuses infections telles que les infections foeto-maternelles, des méningo-encéphalites et des septicémies. La bactérie utilise préférentiellement le glucose qui est transporté via le système phosphoenolpyruvate:sucre phsosphotransferase (PTS) et des perméases non-PTS. Les deux principaux transporteurs de glucose chez L. monocytogenes seraient des PTS de la classe mannose. Le premier est codé par l’opéron manLMN (man) et le deuxième, par l’opéron mpoABCD (mpo). Nous avons, dans un premier temps, mis en évidence le transport de glucose par ces PTS chez L. monocytogenes et aussi identifier d’autres transporteurs non-PTS de glucose. Des tests de croissance en milieu minimum (MM) additionné de glucose et des tests de consommation de glucose ont permis de montrer que les mutants ΔmanL (manL code pour l’EIIABMan) et ΔmanM (manM code pour l’EIICMan) utilisent moins vite le glucose que la souche sauvage AML73 ou EGDe (3 à 4 fois moins vite). Le mutant ΔmpoA (mpoA code pour l’EIIAMpo) montre un phénotype similaire à la souche sauvage tandis que le mutant ΔmpoB (mpoB code pour l’EIIBMpo) utilise 4 à 5 fois moins vite le glucose que la souche sauvage. Des tests de qRT-PCR ont par ailleurs permis de montrer que la délétion du gène mpoA permet une expression constitutive de l’opéron man tandis que la délétion du gène mpoB entraîne une inhibition de l’expression de cet opéron. Nous avons aussi montré que l’opéron man est induit par le glucose et l’opéron mpo est exprimé constitutivement. Le PTSMan est le principal système de transport de glucose chez L. monocytogenes et le PTSMpo pourrait fonctionner comme un senseur de glucose qui en présence de ce sucre stimule l’expression de l’opéron man en régulant l’activité de ManR. Le mutant ΔptsI (ptsI code pour la protéine générale EI du PTS) utilise 8 à 10 fois moins vite le glucose que la souche sauvage et présente une très faible expression de l’opéron man. L’utilisation du glucose (bien que faible) par le mutant ΔptsI permet d’affirmer qu’il existerait des transporteurs non-PTS qui permettraient à ce mutant d’utiliser le glucose. Des tests de complémentation hétérologue dans la souche E. coli LJ140 (incapable de transporter le glucose) ont permis de montrer que les trois protéines GlcU (GlcU1, GlcU2 et GlcU3, identifiées par homologie de séquences aux GlcU d’autres firmicutes) permettent le transport de glucose chez L. monocytogenes mais avec une très faible affinité. Un rôle potentiel du PTS et des transporteurs non-PTS dans la régulation de PrfA a également été mis en évidence par des tests de dosage β-D-glucuronidase à partir de cultures bactériennes réalisées en milieux liquides ou sur géloses et aussi par des tests de qRT-PCR (pour l’expression des gènes actA et hly). Ces tests ont été réalisés à partir de la souche L. monocytogenes AML73 (portant la fusion Phly-gus) et des mutants ΔmanL, ΔmanM, ΔmpoB, ΔmpoA, ΔptsI et glcU (construits dans cette souche). Les mutations manL, manM, mpoB, ptsI entraînent une augmentation de l’activité de PrfA (de 2 à 14 fois) et une augmentation de l’expression des gènes de virulence PrfA-dépendants (hly et actA) est également observée dans les mutants ΔmanL, ΔmanM et ΔmpoB. Les mutations glcU et mpoA ne montrent aucun effet sur l’activité de PrfA. Les mutants montrant une forte activité de PrfA contiennent peu ou pas de protéine EIIABMan qui est supposée jouer un rôle dans la régulation de l’activité de PrfA par le glucose. L’effet des mutations PTS observé sur l’expression des gènes de virulence dépend de PrfA car cet effet disparaît quand le gène prfA est délété dans les mutants ΔmanL, ΔmanM et ΔmpoB. Les mutations montrant un effet sur l’activité de PrfA ont également été étudiées in vitro par des infections des cellules épithéliales (Caco-2 et Jeg-3) avec les différents mutants et également in vivo dans la souris. La délétion du gène ptsI montre un effet dans l’infection plus particulièrement dans l’entrée des bactéries dans les cellules / L. monocytogenes is a ubiquitous foodborne pathogenic Gram-positive bacterium, which can multiply in host cells and infect humans causing septicemia, spontaneous abortion and méningoencephalitis. This bacterium transports glucose via phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems (PTS) and non-PTS permeases. Two major glucose-transporting PTSs belong to the mannose class. One is encoded by the manLMN (man) operon and the second by the mpoABCD (mpo) operon. One goal was to study the transport of glucose by the proteins encoded by these operons and to identify non-PTS glucose transporters. Growth studies in MM supplemented with glucose and glucose consumption assays with several mutants revealed that deletion of manL (encodes EIIABMan) or manM (encodes EIICMan) significantly slowed glucose utilization (3- to 4-fold) compared to the WT AML73 or EGDe strain. Deletion of mpoA (encodes EIIAMpo) had no significant effect on glucose utilization (same phenotype as the WT) whereas deletion of mpoB (encodes EIIBMpo) significantly slowed glucose utilization (4- to -5 fold). By using qRT-PCR, we show that expression of the man operon is induced by glucose, whereas the mpo operon is expressed constitutively. Nevertheless, deletion of mpoA causes constitutive man operon expression whereas deletion of mpoB inhibits it. The PTSMpo therefore functions as a constantly synthesized glucose sensor regulating man operon expression. Deletion of ptsI (encodes the general PTS component EI) also inhibits man expression and the ΔptsI mutant was most strongly impeded in glucose utilization. The residual glucose uptake probably owes to three GlcU-like non-PTS transporters. The successful heterelogous complementation of the E. coli LJ140 strain, wich is unable to transport glucose, suggests that the L. monocytogenes GlcU proteins, GlcU1, GlcU2 and GlcU3 (identified by sequences homology to GlcU proteins in other firmicutes) are indeed capable of transporting glucose.A potential role of PTS and non-PTS components in PrfA regulation was studied in the L. monocytogenes AML73 strain (contains a Phly-gus fusion) and in the ΔmanL, ΔmanM, ΔmpoB, ΔmpoA, ΔptsI, glcU mutants derived from it. For that purpose, I carried out β-D-glucuronidase activity tests with bacteria grown either in liquid or on solid medium and qRT-PCR experiments (expression of actA and hly genes). Interestingly, deletion of ptsI, manL, manM and mpoB caused elevated PrfA activity (2- to -14 fold) and elevated expression of virulence gene expression (actA and hly) in the ΔmanL, ΔmanM and ΔmpoB mutants was observed. Nevertheless, glcU inactivation and mpoA deletion had no effect on PrfA activity. The elevated PrfA activity disappeared when the prfA gene was also deleted in the ΔmanL, ΔmanM and ΔmpoB mutants, confirming that the stimulatory effect of the various mutations on virulence gene expression is PrfA-dependent. All mutants exhibiting elevated virulence gene expression contain no or only little unphosphorylated EIIABMan, which we therefore suspect to play a major role in glucose-mediated PrfA inhibition. The effect of the PTS mutations was also tested in in vitro host cells infection assays (Caco-2, Jeg-3 cells) and in an in vivo mouse model. Deletion of ptsI led to elevated infection of the host cells, which probably owes to the elevated synthesis of the InlA protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2011PA112047 |
| Date | 29 April 2011 |
| Creators | Ake, Francine Désirée Moussan |
| Contributors | Paris 11, Deutscher, Josef |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image |
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