Magíster en Bioquímica área de Especialización en
Bioquímica ambiental / Memoria para optar al Título de
Bioquímico / Los problemas ambientales y la disminución de las reservas de petróleo han reiniciado la
búsqueda de combustibles alternativos a los combustibles fósiles. El etanol se presenta como una
alternativa sustentable para resolver esta problemática.
En la naturaleza existen microorganismos silvestres productores de etanol, tales como la
bacteria Zymomonas mobilis y la levadura Saccharomyces cerevisiae. Si bien estos dos
microorganismos son altamente eficientes en la generación de etanol, sólo son capaces de
utilizar azúcares de 6 carbonos, limitando la producción industrial de etanol solo a materias
primas que contengan hexosas.
En los residuos lignocelulósicos se encuentra una gran reserva de hidratos de carbono
almacenada como polímeros de glucosa (celulosa) o azúcares de 5 carbonos como xilosa y
arabinosa.
Para el aprovechamiento de pentosas disponibles en esta materia prima se han modificado
estos microorganismos, mediante la introducción de los genes de las enzimas necesarias para
metabolizar arabinosa y xilosa o se han incorporado los genes de las enzimas de la ruta
etanológica de Z. mobilis, piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa II (adhB) a
bacterias capaces de utilizar pentosas, como Escherichia coli, Klebsiella oxycota, Lactobacillus
plantarum, Lactococcus lactis y Bacillus subtilis.
El género Pseudomonas, principalmente Pseudomonas aeruginosa, posee muchas de las
características necesarias para la producción industrial de etanol, es una versátil bacteria Gram
negativo, capaz de adaptarse y sobrevivir bajo amplio rango de condiciones ambientales y al
igual que Z. mobilis asimila azúcares por la ruta de Entner-Doudoroff, además posee una
toleracia a etanol mayor que bacterias E. coli recombinantes utilizadas en la producción de
etanol.
El objetivo general de este trabajo es la construcción de un operón productor de etanol para la
expresión de los genes pdc y adhB de la ruta etanologénica de Z. mobilis en P. aeruginosa
PAO1. El diseño del operón artificial incluyó los siguientes elementos genéticos: el promotor del
operón inducible arabinosa (PBAD), sitio de unión a ribosoma (RBS), gen pdc, gen adhB y un
terminador transcripcional para P. aeruginosa.
Las primeras etapas para la construcción del operon pet, contemplaron la realización de 2
construcciones genéticas mediante PCR. La primera comprende la mínima región codificante
del gen pdc y una región adaptadora de 33 pb (adp), la segunda corresponde a la unión de adp2
(secuencia que contiene una zona complementaria a adp y un sitio de unión a ribosoma) con la
mínima región codificante del gen adhB y un terminador transcripcional específico para
Pseudomonas.
Los análisis de restricción, PCR y secuenciación mostraron la obtención de un fragmento
1740 pb correspondiente al producto pdc-adp, un fragmento de 1247 pb para el producto adp2-
adhB-term. Para los productos de PCR de la fusión de las construcciones pdc-adp con adp2-
adhB-term se obtuvieron amplicones inespecíficos de tamaños superiores e inferiores al tamaño
teórico esperado (3 Kb). De manera alternativa para la obtención de la construcción que
contenga los genes pdc y adhB con la secuencia adaptadora y de unión a ribosoma, se realizaron
reacciones de ligación de ambos fragmentos utilizando la enzima T4 DNA ligasa, las cuales
fueron clonadas en el vector pSC-B. De todos los clones analizados solo uno contenía la
construcción esperada (plasmidio pCL27-B), pero los análisis de PCR revelaron que los genes
no se encontraban en la orientación adecuada, por lo tanto no fue posible obtener la construcción
del fragmento pdc-adp-RBS-adhB, construcción clave en el término de la construcción del
operón pet. / Environmental problems and declining oil reserves have resumed the search for alternative
fuels to fossil fuels. Ethanol is presented as a sustainable alternative to solve this problem.
In nature there are wild ethanol producing microorganisms, such as bacteria Zymomonas
mobilis and yeast Saccharomyces cerevisiae. While these two microorganisms are highly
efficient in the generation of ethanol, are capable of using only 6 carbon sugars, limiting the
industrial production of ethanol only to raw material containing hexoses.
In lignocellulosic waste there is a large reservoir of stored carbohydrates like glucose
polymers (cellulose) or 5-carbon sugars such as xylose and arabinose.
For the utilization of available pentoses in this raw material, such microorganisms have been
modified by the introduction of genes of the necessary enzymes to metabolize arabinose and
xylose or enzymes genes have been incorporated of etanologic pathway from Z. mobilis,
pyruvate decarboxylase (pdc) and alcohol deshidrogenasa II (adhB) to bacteria capable to use
pentoses, such as Escherichia coli, Klebsiella oxycota, Lactobacillus plantarum, Lactococcus
lactis and Bacillus subtilis.
The genus Pseudomonas, mainly Pseudomonas aeruginosa, has many of the features
needed for industrial production of ethanol, is a versatile Gram negative bacteria, able to adapt
and survive under wide range of environmental conditions and like Z. mobilis assimilated sugars
by the Entner-Doudoroff pathway, and in addition has ethanol higher tolerance than recombined
E. coli bacteria used in the production of ethanol.
The overall aim of this work is the construction of an ethanol producer operon for the
expression of pdc and adhB genes from the Z. mobilis etanologic pathway on P. aeruginosa
PAO1.
The artificial operon design included the following genetic elements: the arabinose inducible
operon promoter (PBAD), ribosome binding site (RBS), pdc gene, adhB gene and a transcriptional
terminator to P. aeruginosa. The first step to construct the pet operon, contemplated 2 genetic constructs by PCR. The first
involves a pdc gene minimum coding region and a adapter region of 33 bp (adp), the second
corresponds to the union of adp2 (sequence that contains a complementary zone to adp and a
ribosome binding site) with adhB gene minimal encoding region and a specific transcriptional
terminator to Pseudomonas.
The restriction analysis, PCR and sequencing showed the obtention of a 1740 pb fragment
corresponding to the pdc-adp product, a 1247 pb fragment for the product adp2-adhB-term. For
the PCR products of pdc-adp and adp2-adhB-term construction fusion, non specific amplicons
were obtained in higher and lower sizes than the theoretical size expected (3 Kb). Alternatively
for the obtention of the construction which have the pdc and adhB genes with the adapter
sequence and ribosome binding, ligation reactions were performed of both fragments using T4
DNA ligase enzyme, which were cloned on the vector pSC- B. Of all the clones analyzed just
one contained the expected construction (plasmid pCL27-B), but PCR analysis revealed that
genes were not in the proper orientation, therefore it was not possible to obtain the construction
of fragment pdc-adp-RBS-adhB, key construction in the completion of the pet operon
construction.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/113568 |
| Date | 12 1900 |
| Creators | Navarro Pérez, Myriam Andrea |
| Contributors | Corsini, Gino, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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