Neste trabalho foram investigados os mecanismos e o perfil cinético de processos nitrosativos do ponto de vista da nitrosação do indicador 4,5-diamino fluoresceina (DAF2) em células do tipo RAW 264.7. Também foi investigado o papel que ferro lábil (LIP) exerce em tais processos. O estudo cinético mostrou que a nitrosação do DAF2 é dependente de superóxido intracelular e se processa por dois mecanismos distintos denominados nitrosilação oxidativa e nitrosação. Observou-se que o perfil cinético da nitrosaçao do DAF2 sofre uma transição passando de dependente para independente com relação à concentração de NO, quando a concentração de NO se aproxima de 100-110nM. Este perfil está relacionado com a dinâmica de recombinação entre NO e O2¯ que dispara todo o processo de nitrosação do DAF2. No trabalho fica claro que processos nitrosativos que ocorrem pelos mesmos mecanismos podem apresentar perfis cinéticos completamente diferentes dependendo da localização onde ocorre a recombinação entre NO e O2¯. O ponto mais interessante foi a constatação de que quelantes permeáveis à membranas biológicas estimulam a nitrosação do DAF2 intracelular. Este efeito é decorrente da remoção de LIP intracelular que, surpreendementemente, apresenta papel antinitrosativo nas condições experimentais estudadas. O papel incomum antinitrosativo apresentado por LIP é analizado do ponto de vista da reação entre LIP e ONOO¯ que tem como produto nitrito, uma espécie não nitrosante. Estes resultados podem alterar a forma como LIP é visto em processos oxidativos e nitrosativos. / In this work, we investigated the mechanisms and kinetic profiles of nitrosative processes using fluorescent indicator 4,5-diaminofluorescein (DAF2) in RAW 264.7 cells. The labile iron pool (LIP) influence in nitrosative processes was also evaluated. Intracellular DAF2 nitrosation is superoxide dependent and proceeds by two distinct mechanisms: Oxidative nitrosylation and nitrosation. The former mechanism is the most relevant under all experimental conditions tested. Interestingly, the DAF2 nitrosation rate increases linearly with NO concentration of up 100-110 nM but thereafter undergoes a sharp transition and becomes insensitive to NO. This peculiar kinetic behavior has never been reported and it is linked with NO and superoxide recombination dynamics. When NO reaches a concentration capable to outcompete superoxide dismutase for superoxide, the rate of DAF2 nitrosation becomes insensitive to NO. The most striking finding is the LIP´s influence in nitrosative processes. LIP removal by cell membrane permeable metal chelantors increases DAF2 nitrosation rate significantly, suggesting tha LIP can act as an anti-nitrosant species. This increase is probably related with LIP´s direct reaction with peroxynitrite, wich produces non-nitrosant species like nitrite. This controversial LIP´s anti-nitrosative role in cellular systems is rather interesting since it can change the way we understand it´s role in nitrosative and oxidative processes.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-20042016-065052 |
| Date | 23 February 2016 |
| Creators | Fernando Cruvinel Damasceno |
| Contributors | José Carlos Toledo Junior, Daniel Junqueira Dorta, Flavia Carla Meotti, Hugo Pequeno Monteiro, Roberto Santana da Silva |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Química, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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