Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden.
Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet.
Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt.
Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen.
Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken.
Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird.
Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert.
Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden.
Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.:Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Zielstellung 7
3 Theoretischer Teil 9
3.1 Monoklonale Antikörper 9
3.2 Endoradionuklidtherapie mit Hilfe radiomarkierter Antikörper 11
3.3 Pretargeting-Konzepte zur Anwendung in der Radioimmuntherapie 12
3.3.1 Kennzeichen des Tumor-Pretargeting 12
3.3.2 Pretargeting unter Nutzung bispezifischer monoklonaler Antikörper 13
3.3.3 Das (Strept)avidin/Biotin-System 16
3.3.4 Komplementäre Oligonukleotide 20
3.3.4.1 D-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als komplementäres System für Pretargeting-Anwendungen 20
3.3.4.2 L-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als potentielle und stabile Komponenten für das Pretargeting von Tumoren 23
3.3.4.3 Pretargeting-Konzept mit L-konfigurierten Oligonukleotiden – Bisherige Arbeiten im HZDR 24
3.4 Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) als potentielles Target für Pretargeting-Anwendungen 28
3.4.1 Die Biologie des EGFR und dessen Funktion in der Onkogenese 28
3.4.2 Der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab 30
3.4.3 Antikörper vermittelte Rezeptorinternalisierung - ein Ausschlusskriterium für das Pretargeting? 32
4 Ergebnisse und Diskussion 35
4.1 Verwendete komplementäre L-DNA-Leitstruktur, Chelatoren und Radionuklide 35
4.2 Darstellung der Radionuklid markierbaren Komponente des Pretargeting Systems 39
4.2.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 39
4.2.2 Konjugation von 17mer-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 1a-e mit NOTA-Bn-thioharnstoff-ethyl-maleinimid 5 und DOTA-GA-Mal 7 41
4.3 Darstellung der targetspezifischen Komponente – Funktionalisierung von Cetuximab mit komplementärer L-DNA 44
4.3.1 Synthesestrategie 44
4.3.2 NOTA-Funktionalisierung von Cetuximab 46
4.3.2.1 Syntheseplanung und Durchführung 46
4.3.2.2 Analytische Charakterisierung des Derivates 47
4.3.3 Maleinimid-Funktionalisierung von NOTA3-C225 51
4.3.3.1 Syntheseplanung und Durchführung 51
4.3.3.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 53
4.3.4 Konjugation von NOTA3-C225-Malk mit komplementärer 17mer-L-DNA 2 55
4.3.4.1 Syntheseplanung und Durchführung 55
4.3.4.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 56
4.4 Radiochemische Synthesen 61
4.4.1 68Ga-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 61
4.4.2 64Cu-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 63
4.4.3 64Cu-Markierung NOTA funktionalisierter Cetuximab-Derivate 65
4.4.3.1 Entwicklung einer Methode zur schonenden Radiomarkierung von Antikörpern mit 64Cu 65
4.4.3.2 Analytische Charakterisierung der 64Cu-markierten Cetuximab-Derivate mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 67
4.4.4 177Lu-Markierung von DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d 70
4.5 In-vitro-Charakterisierung und Bewertung des Pretargeting-Systems auf dessen Eignung für In-vivo-Anwendungen 72
4.5.1 Vorüberlegungen 72
4.5.2 Untersuchungen zur Oberflächenladung modifizierter Cetuximab- Derivate 74
4.5.3 Schmelzpunktbestimmung zur Bewertung der Hybridstabilität 77
4.5.3.1 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/c-L-DNA- Hybride 77
4.5.3.2 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 77
4.5.3.3 Die Schmelztemperatur der NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 78
4.5.4 Untersuchungen zur Bestimmung der Abhängigkeit von PEG-Substituenten unterschiedlicher Größe auf das Hybridisierungs- verhalten 79
4.5.4.1 Vorbetrachtung 79
4.5.4.2 Hybridisierungsuntersuchungen in Phosphatpuffer 79
4.5.4.3 Hybridisierungsuntersuchungen in humanem Vollblut 81
4.5.5 Kompetitionsbindungsstudien zur Bestimmung der Affinität von konjugierten Cetuximab-Derivaten 82
4.5.5.1 Vorbetrachtung 82
4.5.5.2 Kompetitionsbindungsstudien an A431-Zellhomogenaten 83
4.5.5.3 Kompetitionsbindungsstudien an FaDu-Zellhomogenaten 84
4.5.5.4 Schlussfolgerungen 85
4.5.6 Sättigungsbindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 87
4.5.6.1 Vorbetrachtung 87
4.5.6.2 Sättigungsbindungsstudien an A431-Zellen 88
4.5.6.3 Sättigungsbindungsstudien an FaDu-Zellen 91
4.5.6.4 Schlussfolgerungen 95
4.5.7 Pretargeting-Bindungsstudien von NOTA3-C225-(c-L-DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 mit [64Cu]Cu6a-e an A431- und FaDu-Zellen 98
4.5.7.1 Vorbetrachtung 98
4.5.7.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 99
4.5.7.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 101
4.5.7.4 Schlussfolgerungen 103
4.5.8 Internalisierungs-Bindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 103
4.5.8.1 Entwicklung eines geeigneten Internalisierungsassays basierend auf dem Pretargeting-Konzept 103
4.5.8.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 106
4.5.8.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 113
4.5.8.4 Schlussfolgerungen 119
4.6 In-vivo-Pretargeting-Studien 121
4.6.1 Untersuchung der In-vivo-Stabilität und Bluteliminierung von [64Cu]Cu-NOTA-L-DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) 121
4.6.2 Kleintier-PET-Untersuchung von [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 zur Ermittlung der Pretargeting-Wartezeit 123
4.6.3 Pretargeting-Kleintier-PET-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [68Ga]Ga-NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG ([68Ga]Ga6a-e) in Mäusen 125
4.6.4 Pretargeting-Studien von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [64Cu]Cu-NOTA-L DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) in Mäusen 129
4.6.4.1 Kleintier-PET-Untersuchungen an FaDu tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 129
4.6.4.2 Bioverteilung nach Pretargeting-Experimenten an A431 tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 132
4.6.5 Pretargeting-SPECT-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG ([177Lu]Lu8d) 134
4.7 Abschließende Bewertung von Cetuximab auf dessen Eignung als Antikörper für das Tumor-Pretargeting 135
5 Zusammenfassung und Ausblick 137
6 Experimenteller Teil 141
6.1 Material 141
6.1.1 Chemikalien 141
6.1.2 Puffergemische und Lösungen 143
6.1.3 Synthetische L-Oligonukleotide 146
6.1.4 Radionuklide 146
6.1.5 Zellkulturen 146
6.1.5.1 A431-Zelllinie 146
6.1.5.2 FaDu-Zelllinie 147
6.1.6 Tiermodelle 147
6.1.7 Geräte 148
6.2 Analytische Methoden 149
6.2.1 NMR-Spektroskopie 149
6.2.2 Massenspektrometrie 149
6.2.2.1 ESI-MS 149
6.2.2.2 Maldi-TOF 150
6.2.3 UV/Vis-Spektroskopie 150
6.2.4 Chromatographie 151
6.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 151
6.2.4.2 Hochleistungsflüssigchromatographie 151
6.3 Synthesevorschriften und analytische Daten 153
6.3.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 153
6.3.2 Synthese der NOTA und DOTA funktionalisierten 17mer-L-DNA- Verbindungen 154
6.3.3 Synthese konjugierter Cetuximab-Derivate 157
6.3.4 Radiochemische Synthesen 161
6.3.4.1 68Ga-Radiomarkierungen 161
6.3.4.2 64Cu-Radiomarkierungen 163
6.3.4.3 177Lu-Radiomarkierungen 167
6.4 Biologisch-chemische Methoden 168
6.4.1 Schmelzpunkt-Bestimmung Fehler! Textmarke nicht definiert.
6.4.2 Gelelektrophorese 168
6.4.2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 168
6.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 169
6.4.2.3 Isoelektrische Fokussierung (IEF) 170
6.4.3 Zellkultur 170
6.4.3.1 Auftauen und Anzüchten von kryokonservierten Zellen 170
6.4.3.2 Kryokonservierung von Zelllinien 170
6.4.3.3 Subkultivierung 171
6.4.3.4 Zellzahlbestimmung 171
6.4.3.5 Herstellung von Zellhomogenat 172
6.4.4 Hybridisierungs- und Bindungsassays 172
6.4.4.1 In-vitro-Hybridisierungsuntersuchungen 172
6.4.4.2 Kompetitionsassay an Zellhomogenat 173
6.4.4.3 Sättigungsbindungsstudien an intakten Zellen 174
6.4.4.4 Pretargeting-Bindungsstudien 175
6.4.4.5 Internalisierungs-Bindungsstudien 176
6.4.4.6 Bicinchoninsäure-Assay (BCA) zur Proteinbestimmung 177
6.4.4.7 Gammacounter 177
6.4.5 Metabolitenanalytik 178
6.4.6 Bioverteilungsuntersuchungen 178
6.4.7 Positronen-Emissions-Tomographie (PET) 179
6.4.8 Single-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) 179
7 Anhang 180
7.1 Originaldaten 180
7.1.1 Schmelzkurven 180
7.1.2 Gelelektrophorese und Autoradiographie 181
7.1.3 Bioverteilungsdaten 186
7.2 Übersicht der Substanzen 188
7.3 Abkürzungsverzeichnis 191
7.4 Literaturverzeichnis 194
7.5 Pubblikationen, Poster und Vorträge 209
7.6 Danksagung 212
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:29181 |
| Date | 17 November 2015 |
| Creators | Schubert, Maik |
| Contributors | Steinbach, Jörg, Vogel, Marina, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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