A fragmentação do DNA espermático é uma das principais causas de infertilidade nos machos. Alterações na integridade do DNA podem ser decorrentes da ação de espécies reativas de oxigênio (EROS), de defeitos na protaminação e da apoptose. A sensibilidade do espermatozoide ovino frente as biotecnologias reprodutivas pode ser resultado de uma alta suscetibilidade a ação de EROS ou alterações na protaminação espermática desencadeadas por estresse oxidativo induzido por estresse térmico, tornando o espermatozoide mais suscetível a fragmentação de DNA. Com o objetivo de entender mais este processo, foi realizado um primeiro experimento para avaliar o status oxidativo, os atributos espermáticos e a expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de protaminação em diferentes níveis de suscetibilidade a peroxidação lipídica (baixo, médio, alto e altíssimo) em sêmen ovino. Foi observado um aumento da atividade enzimática da glutationa peroxidase e uma diminuição da atividade enzimática da glutationa redutase no plasma seminal no grupo com suscetibilidade a peroxidação lipídica alta e altíssima. Com relação a catalase, não foi verificado esse aumento, no entanto houve maior imunodetecção desta enzima. Em relação a condição espermática, observou-se um aumento na porcentagem de defeitos totais e lesões nas membranas acrossomal e plasmática, além de porcentagens menores de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial no grupo com maior suscetibilidade a peroxidação lipídica. Este mesmo grupo também apresentou alta suscetibilidade ao dano da cromatina e aumento do número de cópias do gene da protamina 1 (PRM1) em espermatozoides. O segundo experimento avaliou os atributos de espermatozoides provenientes do ejaculado e do epidídimo frente ao estresse térmico induzido por insulação testicular (tratado), assim como as relações com o status antioxidante. Observou-se diminuição da motilidade, vigor, turbilhonamento e aumento na porcentagem de defeitos maiores e menores, e de lesões na membrana acrossomal e plasmática em espermatozoides ejaculados no grupo tratado. Essas diferenças não foram observadas em espermatozoides epididimais. Uma maior atividade enzimática da glutationa peroxidase e da glutationa redutase foi observada no plasma seminal do grupo tratado. Foi verificado uma diminuição de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado, indicando que o metabolismo mitocondrial parece estar envolvido no quadro de estresse oxidativo. Um terceiro estudo foi conduzido para verificar o efeito do estresse térmico na integridade da cromatina espermática, na protaminação do DNA espermático e na ativação de vias apoptóticas em testículo ovino. Em espermatozoides provenientes do ejaculado, houve um aumento da porcentagem de células com suscetibilidade a fragmentação da cromatina no grupo tratado; não observado em espermatozoides epididimais. Uma alta porcentagem de espermatozoides com fragmentação de DNA grau III (ensaio COMETA) e aumento do número de cópias de mRNA da proteína de transição 1 (TNP1) em espermatozoides provenientes do ejaculado, foi observada no grupo tratado. Já em espermatozoides provenientes do epidídimo, a PRM1 apresentou maior expressão no 30ο dia do ciclo espermático comparado a 7ο dia, enquanto que a TNP1 comportou-se de maneira contrária. Em relação a ativação de vias apoptóticas em testículo ovino, a proteína anti-apoptótica Bax foi imuno-identificada em espermatócitos e a Blc-2 em espermátides, sem diferença entre os grupos. Em conclusão, a alta susceptibidade dos espermatozoides ovinos a peroxidação lipídica altera o status oxidativo ocasionando um quadro de estresse oxidativo, principal causador de dano a cromatina. Adicionalmente, o estresse oxidativo induzido por estresse térmico prejudica os atributos espermáticos e aumenta a suscetibilidade dos espermatozoides a fragmentação de DNA. / Sperm DNA fragmentation is referred as one of the main causes of male\'s infertility. Among the etiologies of abnormalities on DNA integrity the action of reactive oxygen species (ROS), protamination failures and apoptosis are considered the most important. The known sensitivity of ram´s sperm to reproductive biotechnologies could be a result of a higher susceptibility to the action of ROS or changes in sperm protamination triggered by oxidative stress induced by heat stress. This would increase the susceptibility of sperm DNA to fragmentation. Initially, the ram sperm quality, seminal protamine gene expression and oxidative status were evaluated in semen samples of different levels of susceptibility to lipid peroxidation (low, medium, high and very high). There was an increase on glutathione peroxidase and decreased glutathione reductase enzymes' activity in groups with high and very high susceptibility to lipid peroxidation. However, only catalase showed increased immunodetection. An increase on total defects and damaged acrosomal and plasmatic membranes were observed in the group showing the highest susceptibility to lipid peroxidation. Also, the percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential, the percentage of sperm susceptible to chromatin damage and the number of copies of protamine 1 (PRM1) mRNA were increased in the group showing higher susceptibility to lipid peroxidation. The second study evaluated sperm\'s attributes from the epididymis and ejaculated sperm subjected to heat stress induced by testicular insulation (treated group), as well as correlations with the antioxidant status. We observed decrease on motility, vigor, and mass motility and increase on the percentages of sperm showing major and minor defects, and damaged plasma and acrosome membranes in the treated group. These differences were not observed in epididymal sperm. Increased enzymatic activities of glutathione peroxidase and glutathione reductase were observed in the treated group. Mitochondrial metabolism appeared to be involved in the oxidative homeostasis imbalance. This was effectively observed by a decrease on the percentage of sperm with high mitochondrial membrane potential in the treated group. A third study was conducted to determine the effect of heat stress induced by testicular insulation on the integrity of chromatin, protamination and apoptotic activation pathway in ram testis. An increase on the percentage of sperm with susceptibility to chromatin fragmentation in the treated group was observed. However, the previous findings were not observed in epididymal sperm. A higher percentage of sperm showing DNA fragmentation level III (Comet assay) and an increase on the number of copies of transition protein 1(TNP1) mRNA were observed in the treated group. In epididymal sperm, a higher expression of the PMR1 gene was observed on the 30th day of the espermatogenic cycle, while TNP1 behaved contrarily. In the testicular samples, the anti-apoptotic protein Bax was detected only in spermatocytes while Bcl-2 was observed singularly in spermatids, with no difference between groups. In conclusion, the disruption of oxidative homeostasis may be exacerbated by the higher susceptibility of ram\'s sperm to lipid peroxidation, which could be the main etiology of chromatin damage. In addition, oxidative stress induced by heat stress impairs sperm attributes and DNA integrity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17032015-153439 |
| Date | 17 December 2014 |
| Creators | Hamilton, Thais Rose dos Santos |
| Contributors | Assumpção, Mayra Elena Ortiz D'Avila |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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