Das proinflammatorische Zytokin Interleukin-1 (IL-1) spielt eine zentrale Rolle bei Entzündungen und Infektionen. Die zellulären Antworten von IL-1 werden über den IL-1-Rezeptor Typ I (IL-1RI) vermittelt. Adapterproteine und die IL-1RI-assoziierte Kinase IRAK werden nach Ligandenbindung an den Rezeptor rekrutiert. Nach ihrer Phosphorylierung dissoziiert die IRAK vom IL-1RI-Komplex und aktiviert weitere Kinasen, was letztendlich zur Aktivierung von NF-κB und zur Induktion der Transkription von Genen führt. Für eine adäquate Immunantwort ist ein intrazellulärer reduzierter Status von Proteinthiolen essentiell. Vorausgegangene Untersuchungen an der murinen Thymomzelllinie EL-4 zeigten, dass die IL-1-Signalkaskade durch thiolmodifizierende Substanzen wie Menadion (MD) oder Phenylarsinoxid (PAO) gehemmt wird. Eine IL-1-abhängige Aktivierung von IL-1RI-assoziierte Kinasen oder NF-κB fand nicht mehr statt.<br><br>
Ziele dieser Arbeit waren: (i) mögliche Proteine, die für den Angriff von thiolmodifizierenden Agenzien ein Ziel sein könnten, zu identifizieren und (ii) den Einfluss nahrungsrelevanter und redoxaktiver Substanzen auf frühe Ereignisse der IL-1-Signaltransduktion wie der Bildung des IL-1RI-Komplexes zu untersuchen. Als Zellmodell wurden EL-4-Zellen mit stabil überexprimierter IRAK (EL-4<sup>IRAK</sup>) verwendet. Um die Bildung des IL-1RI-Komplexes, anschließende Phosphorylierungsereignisse und somit Kinase-Aktivitäten nachzuweisen, wurden Co-Präzipitations-Experimente und <i>in vitro</i> Kinase Tests durchgeführt. Die Markierung von Proteinthiolen erfolgte mit dem thiolspezifischen Reagenz Iodoacetyl-[<sup>125</sup>I]-Iodotyrosin ([<sup>125</sup>I]-IAIT).<br><br>
Die Vorbehandlung von EL-4<sup>IRAK</sup>-Zellen mit MD oder PAO führte zu einer Hemmung der Rekrutierung der IRAK an den IL-1RI und der anschließenden Phosphorylierungen. Zur Identifikation weiterer IL-1RI-assoziierter Proteine wurden IL-1RI-Immunpräzipitate zweidimensional aufgetrennt, Colloidal-Coomassie gefärbte Proteinspots ausgeschnitten und anschließend massenspektrometrisch mittels ESI-Q-TOF analysiert. Bei der Analyse wurden Proteine des Cytoskeletts wie z. B. Actin identifiziert.<br><br>
In Analogie zu den synthetischen Substanzen MD und PAO wurden nahrungsrelevante und redoxaktive Substanzen wie Curcumin (Gelbwurz) und Sulforaphan (Broccoli) eingesetzt, um zu untersuchen, ob sie bereits früh die IL-1-Signaltransduktion beeinflussen. Bislang sind antiinflammatorische Effekte dieser beiden Nahrungsinhaltsstoffe nur auf der Ebene der Zytokin-vermittelten Aktivierung von NF-κB beschrieben. Sowohl Curcumin als auch Sulforaphan blockierten konzentrationsabhängig die Assoziation der IRAK an den IL-1RI in EL-4<sup>IRAK</sup>-Zellen, wobei beide Substanzen unterschiedlich wirkten. Curcumin beeinflusste die IRAK-Aktivierung durch direkte Modifikation von Thiolen der IRAK ohne die Bindung von IL-1 mit dem IL-1RI zu beeinträchtigen. Sulforaphan hingegen induzierte auf mRNA- und Proteinebene die Expression von Tollip, welches durch PCR bzw. Western Blot nachgewiesen wurde. Tollip, ein negativer Regulator in TLR/IL-1RI-Signalkaskaden, könnte somit nach Induktion die IRAK-Aktivierung unterdrücken. Die Sulforaphan-abhängige Induktion der Tollip-Expression erfolgte jedoch nicht über Nrf2 und "antioxidant response element" (ARE)-regulierte Transkription, obwohl Sulforaphan ein bekannter Nrf2-Aktivator ist.<br><br>
Diese Ergebnisse veranschaulichen, dass die IRAK ein redoxsensitives Protein ist und für die Bildung des IL-1RI-Komplexes reduzierte Proteinthiole eine Voraussetzung sind. Der Angriffspunkt für die antiinflammatorische Wirkung der beiden Nahrungsbestandteile Curcumin und Sulforaphan ist die Bildung des IL-1RI-Komplexes als ein frühes Ereignis in der IL-1-Signalkaskade. Die Hemmung dieses Prozesses würde die in der Literatur beobachteten Inhibitionen der abwärts liegenden Signale wie die Aktivierung von NF-κB und die Induktion proinflammatorischer Proteine erklären. / The pro-inflammatory cytokine Interleukin-1 (IL-1) generates cellular responses in infection and inflammation. Effects of IL-1 are mediated by the IL-1-receptor type I (IL-1RI). Following ligand binding the IL-1RI-associated kinase IRAK is recruited to the IL-1RI. After phosphorylation and dissociation of IRAK from the receptor different adapter proteins and kinases are activated finally leading to translocation of NF-κB into the nucleus and induction of gene expression. An intracellular reduced state of cysteine residues (thiols) of proteins is necessary for an appropriate IL-1 response. It was shown recently, that preincubation of murine thymoma EL-4 cells with the thiol modifying agents menadione (MD) or phenylarsine oxide (PAO) completely abolished e. g. the IL-1-induced activation of NF-κB. <br><br>
The question to answer therefore was: (i) what are the proteins requiring free thiols and (ii) is the complex formation also influenced by dietary compounds exhibiting anti-inflammatory effects and being able to react with thiols in proteins. As a model the EL-4-cell line stably overexpressing IRAK (EL-4<sup>IRAK</sup>) was used. Recruitment of IRAK was followed by its co-precipitation with the IL-1RI by means of Western blotting with an IRAK antibody. IRAK phosphorylation was demonstrated by in vitro kinase assays with the co-precipitates. Free thiols of IL-1RI complex-associated proteins were made visible by Iodo-acetyl-[<sup>125</sup>I]-Iodotyrosine ([<sup>125</sup>I]-IAIT). <br><br>
By combining these methods with pretreatment of cells with MD or PAO, inhibition of recruitment of IRAK was identified as the first step in the IL-1 signaling cascade sensitive to thiol modification. To detect further redox-sensitive IL-1RI-associated proteins, receptor immunoprecipitates were separated by two dimensional gel electrophoresis and protein spots were analyzed by ESI-Q-TOF. In this way proteins of the cytoskeleton, including actin, were identified. <br><br>
In addition to the synthetical compounds MD or PAO the effects of dietary agents were investigated on the IL-1 signaling pathway. Curcumin as a component of turmeric and sulforaphane from broccoli have been described to be redox-active and anti-inflammatory by an impairment of late events in IL-1- and Toll-like receptor (TLR) signaling. Increasing doses of curcumin and sulforaphane blocked the recruitment of IRAK to the IL-1RI in EL-4<sup>IRAK</sup> cells, but these dietary compounds acted by different mechanisms. Curcumin exerted this inhibition not due to an interference with ligand binding to the receptor, it rather modified protein thiols of IRAK. In contrast, sulforaphane had an indirect effect by an induction of Tollip expression, as shown by mRNA (PCR) and protein (Western blot) analysis. Tollip is known as a negative regulator of IL-1- and TLR-mediated signaling and enhanced expression of Tollip mediated by sulforaphane might therefore inhibit IRAK activation. The induction of Tollip expression was not initiated by Nrf2 and antioxidant response element (ARE)-regulated transcription, which is known to be activated by sulforaphane. <br><br>
These results demonstrate that IRAK is a redox-sensitive protein and the complex formation requires a reduced state of proteins involved. Curcumin and sulforaphane act anti-inflammatory by blocking IL-1 signaling pathway at the most early step, explaining its inhibitory effect on further downstream events in pro-inflammatory pathways.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:758 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Jurrmann, Nadine |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Ernährungswissenschaft |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | German |
| Detected Language | English |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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